李宗源，吴耀祖，刘晶劼，刘羽阳，王丽强

1解放军总医院第一医学中心 眼科，北京 100853；2解放军总医院研究生院，北京 100853；3清华大学医学院，北京 100084

角膜内皮细胞(corneal endothelial cell，CECs)起源于神经外胚层，是一层紧密连接组成的单层六边形细胞，附着在角膜后弹力层上，通过Na+-K+- ATP酶和Mg2+- ATP酶主动将角膜基质中的水泵入前房中，在维持角膜脱水状态和透明中起到重要作用。出生时，人类角膜内皮层细胞密度约为5 000/mm2，由于角膜内皮细胞在体内存在有丝分裂抑制，因此CECs随年龄增长细胞密度呈下降趋势。从妊娠中期到10岁之间，细胞密度呈快速的非线性下降趋势，这可能与角膜面积增大、细胞老化和细胞凋亡相关。之后的阶段细胞密度每年以0.6%的速度递减。当角膜损伤、角膜内皮疾病或自然衰老导致细胞密度小于500/mm2时，角膜内皮将失去其泵水功能，从而导致角膜基质水肿、角膜混浊，最终导致视力下降[1]。包括板层角膜移植、穿透性角膜移植、角膜内皮移植在内的角膜移植是一种可靠的治疗方式[2-3]。但角膜供体移植物在世界范围紧缺，工程化角膜移植材料是解决这一问题的新途径。在种子细胞的获取方式上，体外扩增CECs是一种潜在的解决方案。但内皮细胞在体外扩增时内皮间质转化(endothelium mesenchymal transition，EnMT)和细胞衰老制约着这一策略的可行性。近年有研究指出，物理参数如机械硬度可调节细胞EnMT程度。因此我们推测，生物工程底物能够模拟后弹力层的物理机械特性，从而降低CECs细胞体外扩增时的EnMT过程[4]。本研究通过底物对兔角膜内皮生长的影响，旨在改进角膜内皮细胞体外扩增质量，提供工程化角膜内皮材料所需要的种子细胞，为生物工程内皮材料治疗大泡性角膜病变提供前景。

材料与方法

1 实验动物 4 ～ 5周龄、1 ～ 2 kg雌雄不限健康新西兰白兔6只，来自解放军医院实验动物中心。本研究经中国人民解放军总医院动物伦理委员会批准。

2 主要试剂 聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG)(Sigma)、异丙基丙烯酰胺(NIPAM)(Sigma)、丙烯酰胺(Amresco)；6孔细胞培养板(Corning)、24孔细胞培养板(Corning)、48孔细胞培养板(Corning)、48孔板专用细胞爬片(Solarbio)；硫酸妥布霉素溶液；高糖DMEM培养基(Corning)、胎牛血清(FBS)、Express Enzyme(Invitrogen)、胶原酶Ⅰ (Sigma)、山羊血清(中杉金桥)、PBS缓冲液(Corning)、硫酸软骨素(Sigma)、层粘连蛋白(Sigma)、FNC 涂层(ENZO)；小鼠抗兔α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)一抗(Abcam，ab7817)；山羊抗小鼠IgG(Abcam，ab97022)；含DAPI荧光封片剂(中杉金桥)。

3 不同硬度PEGDA水凝胶的制备 本实验使用了清华大学杜亚楠教授团队的可调节硬度的温敏PEG-NIPAM体系。按照文献[4-5]报道的方法制备不同硬度温敏水凝胶：将数均分子量为4 000 g/mol的PEG改性为聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)。用自由基聚合法将NIPAM与丙烯酰胺(acrylamide，AM)和PEGDA共聚。NIPAM和AM的摩尔比是95∶1。在蒸馏水中制备NIPAM/PEGDA溶液，其中NIPAM与PEGDA的重量/体积百分比(NIPAM/PEGDA)分别为1% PEG-NIPAM(NIPAM∶PEGDA=10% ∶ 1%)；10% PEG-NIPAM(NIPAM ∶ PEGDA=10%∶10%)和20% PEG-NIPAM (NIPAM∶PEGDA=10%∶20%)。0.2%的过硫酸铵(APS)和0.1%的四甲基乙二胺用于胶凝固的启动。将配好的溶液浇铸到载玻片上。将PEG-NIPAM水凝胶凝固成型时间统一固定为30 min，制备好的水凝胶需在紫外线照射下灭菌2 h，做细胞培养前需乙醇浸泡1 h，PBS清洗3次。水凝胶材料保存于4℃，通常水凝胶在制备后1周内使用，使用前提前24 h在4℃中进行涂层的预铺板。基于PEG的热敏水凝胶具有良好的光学性能，透明，形态稳定[4,6]。不同硬度水凝胶的体积相变温度均低于生理条件下温度，这使得温度响应型水凝胶适合通过温度控制进行细胞收获，如细胞相互融合，可利用温差变化将细胞成片收下，呈膜样形态。

4 AFM法测定材料硬度 首先用热振动法在玻璃盖玻片上校准悬臂，用洛伦兹函数拟合得到的热谱来确定弹簧常数。测量在37℃的细胞培养基中进行，每次测量得到的力与压痕曲线由JPKSPM数据处理软件利用Hertz模型分析，得到水凝胶的准确模量。

5 原代兔CECs的提取和培养 参照文献[7-8]利用两部法提取兔原代角膜内皮细胞。取4 ～ 5周龄6只新西兰兔完整12只新鲜眼组织，减除多余筋膜肌肉组织，浸泡于含1%青霉素/链霉素/两性霉素B和0.5%硫酸妥布霉素的PBS缓冲液中30 min。PBS缓冲液冲洗干净后沿角膜缘完整剪下角膜组织。将剪下的完整角膜置于高糖DMEM无血清培养基中，利用无齿镊在角膜内皮面完整撕下Descemet膜，注意时刻变换夹取位置，防止损伤内皮细胞，整个过程在体视显微镜下进行。将撕下后带角膜内皮的Descemet膜置于200μl含有2 mg/ml胶原酶的高糖DMEM培养基的48孔板中。37℃孵育3 ～ 4 h后，CECs从Descemet膜上脱落并形成大的细胞团簇。CECs团簇在1×TE酶中进一步消化2 ～ 3 min，进一步分离成更小的团簇和单个细胞，以1 200 r/min离心5 min，在10% FBS、1%青霉素/链霉素/两性霉素B的高糖DMEM中重悬细胞，种植于6孔细胞培养板中，此为细胞P0代。在随后的研究中，通过1×TE分离消化并传代CECs，分别在不同硬度材料和预铺板涂层的条件下培养CECs，具体分组如下：三种预铺板条件(硫酸软骨素、层粘连蛋白混合物；纤维连接蛋白、胶原蛋白、白蛋白混合物；明胶)与不同浓度(1%、10%和20%)PEG制备的PEGNIPAM分别两两组合以及对照组(细胞培养板，TCP)，共10组。当细胞密度约为90%时进行细胞传代，相应组别细胞分别在对应的条件下继续传代培养。所有细胞培养在37℃含5% CO2湿润空气中。隔日更换1次培养基。

6 兔CECs免疫荧光染色 培养细胞在含4%多聚甲醛中固定10 min，PBS洗涤3次×5 min；室温下用0.25% Triton溶液处理15 min，PBS洗涤3次×5 min；10%山羊血清封闭30 min；然后将细胞与目标一抗按照说明书稀释后4℃孵育过夜。复温30 min，PBS洗涤3次×5 min，室温下避光孵育FITC二抗(1：1 000) 1 h，PBS洗涤3次×5 min。所有样品在室温下避光用含DAPI封片剂密封。利用共聚焦显微镜(LEICA SP8)拍摄免疫荧光图像。

7 统计学分析 采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理，本文数据均为计量资料且符合正态分布，以-x±s表示，三组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 水凝胶硬度 利用原子力显微镜AFM法对水凝胶硬度进行测定，浓度1% PEG制备的PEGNIPAM硬度为(346.4±26.53) Pa，浓度为10% PEG制备的PEG-NIPAM硬度为(8 782±444.4) Pa，浓度为20% PEG制备的PEG-NIPAM硬度约为(11 518±791.1) Pa，这些与细胞培养板(TCP)相比均较软(1 GPa)。见图1。

图1 AFM测定不同浓度PEG制备的PEG-NIPAM的弹性模量Fig. 1 PEG-NIPAM hydrogel stiffness was measured through an AFM-based mechanical tester (aP＜0.001)

2 两步法提取兔原代内皮细胞 倒置显微镜下可观察到Descemet膜在液体中自然卷曲，角膜内皮细胞连接紧密，呈六角形规则地排布在Descemet膜上(图2A)。加入胶原酶Ⅰ后，内皮细胞边界皱缩，细胞间紧密连接松散，立体感增强，呈星形形态(图2B、图2C)。进一步消化3 ～ 4 h后，细胞呈大的团簇状脱落，轻轻吹打后，内皮细胞脱离光滑的Descemet膜，进一步加入1×TE酶消化后，大细胞团簇进一步被解离为小的细胞团簇和单个细胞，离心吹打后可制成细胞悬液，这种两步法消化的优势是降低胰酶消化带来的细胞损伤。内皮细胞在12 h后贴壁，呈卵圆状或六边形状，形态规则立体感强(图2D)；随着培养时间增长在细胞接种1 ～ 2 d后，细胞较之前逐渐扁平化，个别细胞出现细胞极性增长，暂时失去典型的六边形和铺路石形态(图2E)；在接种后3 ～ 4 d，随着细胞密度增加，细胞间紧密连接的建立，内皮细胞又恢复了规则的六边形形态(图2F)。

图2 光镜下后弹力层和角膜内皮体外培养形态(10×)A：后弹力层； B、C：加入胶原酶后内皮细胞连接松散与角膜内皮细胞皱缩为星型形态； D、E、F：体外细胞培养12 h、1 d 和4 d 形态Fig. 2 The morphology of thec u l t u red Des c emet ' smembrane and cornealendothelium under opticalmicroscope (10×)A: Descemet's membrane；B, C: After the additionof collagenase, the endothelialcells are looselyconnected, and the cornealendothelial cells contractinto a star shape； D, E, F:Morphology after 12 h, 1 dand 4 d in vitro cell culture

图3 P0 ～ P3代兔原代内皮细胞体外培养光镜下形态和免疫荧光法检测α-SMA表达A、B、C、D： P0、P1、P2和P3代兔CECs光镜下形态，由典型的六边形内皮形态逐渐变为细胞触角增多、极性明显的纤维化细胞形态；E、F、G、H： P0、P1、P2和P3代兔CECs的α-SMA表达，α-SMA阳性细胞密度逐渐增加Fig. 3 Morphology and α-SMA immunof l uorescence expression of P0-P3 rabbit primary CECs in vitro A, B, C, D: Rabbits CECs morphology of P0 (A), P1 (B), P2 (C) and P3 (D). The typical hexagonal endothelial morphology changes into fi brotic cell morphology with proliferating tentacles and obvious polarity； E, F, G, H: Expression of α-SMA in rabbits CECs of P0 (E),P1 (F), P2 (G) and P3 (H). The density of α-SMA positive cells increased gradually

3 兔原代内皮细胞体外培养EnMT变化 将后弹力层上CECs经过三代培养后，细胞三维形态也逐渐由立体形态逐渐变大扁平。采用免疫荧光法检测EnMT标志物α-SMA的表达，以确定除形态变化外，骨架蛋白是否也发生了EnMT过程。在离体后贴壁6 h的兔CECs中，α-SMA没有明显的荧光信号表达，12 h开始出现极少量α-SMA阳性细胞。在P1代检测到少量α-SMA弱阳性细胞。随着细胞培养时间和细胞代数的增加，α-SMA阳性细胞的比例和表达强度逐渐增加，最终细胞骨架呈棘状的非内皮形态(图3)。这些结果表明，EnMT自发地发生在体外培养的兔CECs中。

4 不同硬度水凝胶和涂层对内皮EnMT的影响本实验中3.4 kPa(浓度1% PEG)的基底过于柔软，难以支撑兔CECs的生长，8.8 kPa(浓度10% PEG)的基底细胞生长较11.5 kPa(浓度20% PEG)的基底慢；兔CECs在不含ECM涂层的PEG-NIPAM上，细胞分裂速度非常慢，需要很长时间才能达到融合。在P0 ～ P3培养期间，不同的底物上培养的CECs存在明显差异。不同底物的细胞形态也不相同，但在与兔Descemet膜硬度和组成成分相似的基底(20% PEG-NIPAM，11.5 kPa)中，α-SMA阳性细胞的比例低于对照组TCP(图4)。表明接近原本生物学组成的ECM基底有利于抑制体外EnMT的过程。最终我们们发现与Descemet膜的弹性模量和生物学组成相似的基底将最大程度减少CECs体外培养过程中EnMT的程度。

讨 论

图4 免疫荧光法检测P1 ～ P3代兔原代CECs中α-SMA表达P1 ～ P3代兔CECs在浓度为20%的PEG制备的PEG-NIPAM和TCP表面预铺以层粘连蛋白+硫酸软骨素混合涂层与FNC涂层进行培养，利用免疫荧光法检测α-SMA表达。 P1 ～ P3的CECs中α-SMA阳性细胞逐渐增加，细胞骨架转变为纤维化形态；20% PEGNIPAM相比于TCP对照组α-SMA阳性细胞比例和强度明显减少；层粘连蛋白和硫酸软骨素的混合涂层相比于FNC涂层α-SMA阳性细胞比例和强度减少Fig. 4 α-SMA expression in P1-P3 rabbit CECs by immunof l uorescence P1-P3 rabbit CECs are pre-coated with FNC or laminin + chondroitin sulfate on the surface of PEG-NIPAM or TCP, respectively,and the expression of α-SMA is detected by immunof l uorescence. The α-SMA positive CECs cells of P1-P3 increase gradually, and the cytoskeleton changes into fi brotic morphology. The proportion and fl uorescence intesity of α-SMA positive cells in the 20% PEGNIPAM group signif i cantly decreases compared with the TCP control group. Compared with FNC coating, the α-SMA positive cells proportion and fl uorescence intesity decreases in the laminin and chondroitin sulfate mixed coating

在单细胞和多细胞生物的组织器官和循环系统中，均存在细胞对刺激信号产生极化反应的现象，具体表现为运动能力增强[9]。这种定向运动对于组织发育、血管生成、损伤修复和炎症反应都是必要的。各种刺激会诱导细胞发生运动，这些刺激包括趋化因子、结合性配体和微电流。生化组成上的差异(如胶原蛋白和纤维连接蛋白)也可能导致局部硬度的差异，通过整合素由外向内传导信号影响细胞的运动[10]。通过交联或改变基质浓度可导致微环境的空间变化从而改变硬度，这也是本实验的实验基础。在以往的研究中，坚硬的底物会使细胞发生黏附和重组，这是细胞定向运动过程的开始，伴随着力的产生和传导。以上已经在干细胞、癌细胞、中性粒细胞和血小板中得到证实[11]。除此之外，细胞可依据细胞核的硬度、细胞渗透压和细胞膜感知外界硬度，在亚细胞水平上调节自身的硬度。

以往的研究结果表明，与天然Descemet膜有着相似生物组成和弹性模量的仿生PEG-NIPAM基底可以最大程度维持CECs的表型[12-13]。在此我们利用兔原代CECs在硬度与生物体内相似的粘连蛋白和硫酸软骨素的混合涂层的PEG-NIPAM与其他基底组培养，发现在P1 ～ P3扩增的CECs与其他组相比细胞大小、α-SMA表达等指标得到改善。目前，大部分研究聚焦于广泛的可溶和不可溶分子改善CECs的培养。如CECs在Ⅳ型胶原蛋白、Laminin、FNC和纤连蛋白的涂层上得到了不同程度的有效扩增。其他方法还包括添加可溶性的生长因子，如ROCK抑制剂Y27632、抗坏血酸、bFGF、EGF、TGF-β抑制剂和NGF等[7,14-18]。本实验利用对细胞损伤更小的两部消化法将基质弹性模量与ECM涂层相结合的方式[7]，研究物理因素在细胞动力学和细胞骨架迁移导致EnMT的影响，在不添加额外的生长因子和小分子化合物的条件下，利用DMEM培养基和血清及少量抗生素对比不同基底对CECs的EnMT的影响。我们选择了EnMT的一个明确的细胞骨架标志物α-SMA作为衡量EnMT过程进行研究，其在已转化为成纤维细胞的内皮细胞中会有明显表达。在TCP上标准传代的过程中已确定CECs会在P1代出现表达α-SMA的CECs；在P2和P3时，α-SMA表达的细胞密度增加和表达强度明显增强，并出现清晰的肌动蛋白应力纤维。借助改变PEG浓度进而改变PEG-NIPAM材料的硬度这一特性，我们研究了硬度对CECs对于EnMT的影响。在涂层相同但硬度不同的TCP与其他浓度的PEG-NIPAM基底相比，在与天然结构和硬度相似的仿生基底上，由EnMT导致的α-SMA表达增多的程度最轻。这也表明了物理因素影响着CECs体外培养过程。此外，由于CECs直接在PEG-NIPAM的材料上分裂速度较慢，我们在培养前对材料基底进行预铺板，发现不同涂层对于CECs的培养也具有一定影响，最接近天然ECM成分的涂层细胞生长最好。本研究主要是基于原代细胞的离体实验，还缺少在体动物层面的研究，其作用机制还有待完善。

综上，在全世界角膜移植手术的大量开展，角膜供体严重匮乏，体外培养角膜内皮细胞的效率不能满足工程化角膜内皮移植物生产的大背景下，本研究提供了一个高质量获得工程化角膜内皮材料的种子细胞的思路，希望能在现有的小分子化合物和改良培养方法的基础上通过物理因素的改变更好地获取种子细胞，解决CECs体外扩增的EnMT过程这一关键性问题。我们下一步的实验将研究在角膜内皮体外培养过程中，改变弹性模量是通过哪条通路抑制EnMT过程，争取筛选出特异性靶点以解决世界范围内角膜供体匮乏的难题。