刘晓婷，梁臻龙，陈天艳，张晨晰，张立文，高志英，游艳琴，王成彬

1解放军总医院第一医学中心 医学检验中心，北京 100853；2云南昆钢医院 检验科，云南昆明 650032；3解放军总医院第一医学中心 妇产科，北京 100853

21三体综合征(简称T21综合征)，也称为唐氏综合征，是一种常见的人类非整倍体疾病，约占所有活产胎儿非整倍体的四分之一[1-3]。T21综合征可导致不同程度的身心畸形，其特点是智力低下，发育迟缓，面部特征明显[4-6]。目前，血清学筛查(包括甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素和雌三醇)联合羊膜腔穿刺术是产前筛查和诊断T21综合征的主要方法[7-9]。但是由于血清学筛查的假阳性率高、羊膜腔穿刺术的有创性及培养时间长等缺点，故急需筛选出T21综合征相关特异的标志物，建立针对T21综合征的新型辅助诊断方法。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分[10]。它是研究代谢组在某一时刻细胞内所有代谢物的集合的一门学科。其研究结果可以很好地反映生物体的表型，揭示某些疾病状态或生理状态的分子特征。代谢组学主要研究生物体液、组织以及细胞中的小分子，是基因组与蛋白组学的补充，可以用于生物标志物与疾病发生机制的探索。小分子代谢物对机体内源性和外源性变化较mRNA和蛋白质更敏感，对识别疾病状态下各种代谢物有巨大潜力与价值。目前常用的代谢组学平台有氢核磁共振(1H NMR)、气相色谱联合质谱(GC-MS)、液相色谱联合质谱(LC-MS)以及超高效液相色谱联合质谱(UPLC-MS)[11-15]。核磁共振优点是操作简单及灵活性较好，但灵敏度较低、检测范围有限；气相色谱联合质谱优点是灵敏度和特异性较好，但分析时间较长，且需要衍生化；液相色谱联合质谱灵敏度较高、处理简单，但其分离性能不佳。与传统的液相色谱相比，超高效液相色谱联合质谱具有灵敏度更高、分离速度更快等优点。目前，有关T21综合征的研究多停留在蛋白组学上，代谢组学研究较少。因此本研究应用目前先进的UPLC-MS技术，以期筛选出妊娠母体血清中与T21综合征相关的特异性代谢物，探讨T21综合征发病相关的代谢通路和发病机制。

材料与方法

1 研究对象 16例正常组样品来自胎儿核型正常的孕妇，16例T21组样品来自胎儿核型为T21综合征的孕妇，两组孕妇的年龄、孕周(18 ～ 22周)、所怀胎儿性别等临床资料基本一致，收集两组孕妇的血清各1 ml，300μl/管分装于500μl EP管内，冻存于-80℃冰箱。所有样本均来自于解放军总医院第一医学中心。本研究的所有参加者均已签订科研知情同意书，并经医院伦理委员会批准同意。

2 仪器设备 样品抽提机(Geno/Grinder2010，美国SPEX SamplePrep)；自动化移液机器人(MicroLab STAR®系统，瑞士汉密尔顿公司)；氮吹仪(SPE Dry Dual sample concentrator，美国 Biotag)；超高效液相色谱(Acquity 2D UPLC，美国Waters)；离子轨道阱高质量精度高分辨质谱仪(Q Exactive orbitrap，美国ThermoFisher Scientific)；台式高速冷冻温控离心机(5810-R，美国Eppendorf)；真空冷冻干燥仪(free-Zone，美国LABCONCO)；冰箱(DW-86L728J，中国海尔)。

3 试剂耗材 LC/MS级甲醇(货号34860，HPLC纯，纯度高于99.9%)、甲酸(货号251364，纯度高于96%)和碳酸氢铵(货号A6141，纯度高于99.9%)均购自美国SIGMA公司；EP管(Eppendorf，0.5 ml/1.5 ml)；C18色 谱 柱 (美 国 Waters公 司，UPLC BEH C 18 ～ 2.1 mm×100 mm，1.7μm)；HILIC柱 (美 国 Waters公 司，UPLC BEH Amide 2.1 mm×150 mm，1.7μm)。

4 样品前处理 首先，各样品加入甲醇提取液进行抽提，提取混合液在样品抽提机上垂直震动提取2 min后进行离心。然后，样品中的蛋白质经过有机试剂抽提后变性进入沉淀，上清则含有小分子的代谢物。最后，提取后的每份上清液使用自动化移液机器人分别转移到5块样品板上后用氮吹仪进行吹干，以去除有机溶剂。五块板用途如下。A板：针对亲水性代谢物的正离子电喷雾电离模式(positive ESI)下的反相超高效液相色谱-串联质谱(RP UPLC-MS/MS)分析；B板：针对疏水性代谢物的正离子电喷雾电离模式(positive ESI)下的反相超高效液相色谱-串联质谱(RP UPLC-MS/MS)分析；C板：负离子电喷雾电离模式(negative ESI)下的反相超高效液相色谱-串联质谱(RP UPLC-MS/MS)分析；D板：负离子电喷雾电离模式(negative ESI)下的亲水相互作用超高效液相色谱-串联质谱(HILIC UPLC-MS/MS)分析；E板：即最后一份样品用于需要重新测试时的备用板。

5 超高效液相色谱-串联质谱分析(UPLC-MS/MS)UPLC-MS/MS分析方法均采用Waters ACQUITY 2D超高效液相色谱和使用加热电喷雾离子源HESI-II的Q-Exactive orbitrap高分辨率/高质量精确度质谱仪，以35 000质量分辨率进行扫描。对上述四种样品板分别进行以下操作。A板：该块板上每个吹干的样品溶解在酸性正离子复溶液，用C18色谱柱进行梯度洗脱，洗脱液A和B分别为含有0.05%的全氟化甲酸和0.1%的甲酸的水和甲醇。B板：该块板上每个吹干的样品溶解在酸性正离子复溶液，用C18色谱柱进行梯度洗脱，但是洗脱条件针对更疏水的代谢物进行了色谱优化。洗脱液A和B分别为含有0.05%的全氟化甲酸和0.1%的甲酸的水和甲醇/乙腈。C板：该块板上每个吹干的样品溶解在碱性负离子复溶液，用C18色谱柱进行梯度洗脱，洗脱液A和B分别为含有6.5 mmol/L碳酸氢铵，pH 8.0的水和95%甲醇。D板：该块板上每个吹干的样品溶解在碱性负离子复溶液，用亲水相互作用HILIC柱进行梯度洗脱，洗脱液A和B分别为含有10 mmol/L甲酸铵，pH 10.8的6.5 mmol/L碳酸氢铵，pH 8.0的水和乙腈。MS分析使用动态排除在MS全扫描和数据依赖的MS2扫描之间交替进行。扫描覆盖范围为70 ～1 000 m/z。扫描原始数据储存后进行下一步分析。

6 数据提取和化合物识别 生物信息学系统由四个主要部分组成，实验室信息管理系统、数据提取和峰值识别软件、质量控制和化合物识别数据处理软件，以及一系列用于数据处理分析的统计、可视化和解读工具。这些生物信息学组件的硬件和软件是基于运行Oracle 10.2.0.1企业版的LAN数据服务器。原始数据的质量控制和离子峰的提取使用的是基于使用Microsoft的NET技术构建的Web服务平台，在高性能应用程序服务器和光纤通道存储阵列上运行以提供故障防止和负载平衡。化合物的鉴定是通过与Metabolon自建的数据库中用纯化标准品获得的化合物的特征来进行比对识别的。这些标准品特征包含该标准品在测试系统中的保留时间指数、质量与电荷比(m/z)以及MS/MS。对这三个特征进行比对的标准：一个狭窄的RI窗口、与数据库中标准品的准确质量匹配(+/-10 ppm)以及MS/MS正向和反向比较分数。MS/MS正反比较分数是基于实验数据中的离子与数据库中的标准品离子特征的比较。虽然有些化合物彼此之间可能在这三个指标的某项或者某两项上有相似结果，但在使用所有三个特征来比对以后一般可以得到比较明确的区分。超过4 500种纯化的标准化合物在Metabolon所有分析平台上的数据已经被收藏在Metabolon的数据库中。对于在实验中被反复发现同时尚无数据库匹配的未知代谢物，其特征也被收录在该数据库中。这些未知化合物有可能通过将来获得相应的纯化标准品或经典的结构分析手段来获得识别。

7 统计学分析 采用SPSS23.0统计软件包。常用的数据多元分析法包括非监督模式的分析和有监督模式的聚类分析：1)非监督模式的分析，是按相似性的特征对原始数据分类，把具有同一类特征的样本归类，用可视化技术表达结果。在本实验中使用的非监督模式的统计分析为主成分分析法(principal component analysis，PCA)；2)有监督的聚类分析是利用已获得的信息对未知数据进行归类、识别及预测，在本实验中使用的有监督模式的统计分析是随机森林(random forest，RF)。对正常组和T21组血清中鉴定到的代谢物数据进行Welch t检验进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 主成分分析 经PCA处理的二维矩阵投影图详见图1。图中坐标轴显示Comp.1、Comp.2两种主成分的贡献比例分别为11.24%和7.86%，两种主成分的贡献率之和约20%。因为主成分贡献率之和不高，并不能发现正常组与T21组存在明显差异，但可以生成一个明确边界，如图1虚线所示，用于识别T21组。

图1 正常组与T21组的血清代谢组学PCA分析Fig. 1 PCA analysis of serum metabonomics between the normal group and the T21 group The coordinate axis shows the two principal components that have the most effect on the classif i cation of metabolites, which were represented by Comp.1 and Comp.2, respectively. The percentage values in parentheses indicates the contribution of corresponding principal components

2 随机森林分析 正常组与T21组的血清代谢化合物的RF分析结果见图2。对正常组与T21组的预测准确性为43.8%(约50%)，具有较高的组间分辨能力。同时，结果表明对组间分类贡献靠前的主要代谢物种类包括氨基酸类、糖类、联合因子及维生素类、脂质代谢类、核苷酸代谢类、多肽类等。尤其是氨基酸类，30种代谢物中有11种属于氨基酸超级家族。结果提示，T21综合征的病因可能涉及上述代谢物或者代谢物通路的紊乱。

3 前30种差异显著代谢物分析 表1显示了对正常组与T21组间鉴别贡献最大的前30种代谢化合物。Fold of change (T21/Control)表示各个代谢物在T21组中相对于正常组的倍数，当比值大于1时，表示升高；当比值小于1时，表示降低。P值表示各个代谢物在T21组与正常组之间的统计学差异。P值＜0.05，表明该指标在两组之间存在统计学差异。这些含量差异显著的代谢化合物包括间酪胺磺胺、N1，N12-二乙酰精胺、羧乙基γ-氨基丁酸、邻磺基左旋酪氨酸、戊糖酸、2-氮己环酮、苯酚硫酸盐等，T21组母体血清中约有20种化合物的含量均有不同程度的降低，约10种代谢物水平则升高。

表1 正常组与T21组的前30种血清差异显著代谢产物Tab. 1 Top 30 serum metabolites differentially expressed between normal group and T21 group

讨 论

T21综合征，即唐氏综合征，其发病机制为体细胞内多出的一整条或部分的21号染色体，诱导基因表达的异常，从而导致人体内多种蛋白质表达发生明显改变。代谢组学研究是对生物体内全部代谢物的整体研究，是系统生物科学的重要分支[16-18]。目前，代谢物组学在许多疾病的潜在标志物筛查、复杂疾病或机体病理生理学机制的探索方面逐步应用，在早产或先兆子痫等产科疾病标志物筛查中均有报道，但在T21综合征中的应用研究仍处于探索阶段。我们预测T21综合征患者体内可能伴随着某些代谢通路的改变，以及代谢产物种类及含量的异常变化。由于母体和胎儿之间的血液和各种生化物质的交换一直在动态循环变化，母胎循环中异常改变的代谢产物可能出现在母体血液中。因此，对T21综合征妊娠母体血清进行代谢物组学研究，可能会筛选出T21综合征妊娠相关的具有特异性的代谢标志物。

目前，液相色谱-质谱联用技术(GC-MS)已经取代灵敏度低的核磁共振方法，广泛用于代谢物成分分析[19-22]。代谢组学旨在发现代谢产物的变化，特别是小分子化合物[23]。代谢组学关注的重点在于代谢产物集合的变化，代谢组学分析得到的多维、海量数据必须通过化学计量学的多元统计方法分析处理，才能获得有价值的信息[24-25]。目前，常用的数据多元分析法包括非监督模式的分析和有监督模式的聚类分析[26-27]。非监督模式的分析，是按相似性的特征对原始数据分类，把具有同一类特征的样本归类，用可视化技术表达结果。在本实验中使用的非监督模式的统计分析为主成分分析法。有监督的聚类分析是利用已获得的信息对未知数据进行归类、识别及预测，在本实验中使用的有监督模式的统计分析方法是随机森林分析。在本研究中，主成分分析尽管可以生成一个明确边界在很大程度上识别T21组，但并没有得出基于实验分组的明确区别。可能的原因是人类的异质性往往导致代谢物水平的差异较实验条件下变化更明显，如样本之间孕妇的生活地区、生活习惯、自身体质等有关[28]；另外可能与本研究中的样本量不够多有关。

机体内生成许多相关的代谢产物，主要包括糖类、脂类、氨基酸、核苷酸、多肽、维生素、血红素、有机酸等[29-30]。为了筛选与T21综合征发病可能相关的各种代谢通路的异常变化，鉴定血清含量差异显著的潜在代谢标志物，本研究对T21综合征和正常对照组的代谢物进行了RF分析。结果发现对组间分类贡献靠前的代谢物种类涉及糖类、氨基酸类、血红素代谢类、能量代谢类、脂质代谢类和核苷酸代谢类等。对正常组与T21组间鉴别贡献最大的前30种代谢化合物，包括间酪胺磺胺、N1，N12-二乙酰精胺、羧乙基γ-氨基丁酸、邻磺基左旋酪氨酸、戊糖酸、2-氮己环酮、苯酚硫酸盐等，有望成为T21综合征妊娠产前筛查潜在的代谢标志物。它们分别涉及氨基酸代谢、糖代谢、脂类代谢、多肽代谢、核苷酸代谢、血红素代谢等多种代谢途径。本研究结果提示T21综合征妊娠可能与这些代谢通路异常有密切关系。在30种异常代谢化合物中，其中T21组母体血清中约有20种化合物的含量均有不同程度的降低，约10种代谢物水平则升高，提示21三体综合征的发生可能伴随有代谢水平不同程度的抑制。下一步我们将会对前期在T21综合征羊水代谢组学取得的成果[31]与血浆代谢组学得到的代谢物进行差异分析，以期筛选得到2种体液中的共同代谢物，即与T21综合征相关的特异性代谢物，从而进一步分析T21综合征患者在各种代谢通路中的差异表达，建立T21综合征早期辅助诊断模型，以指导临床针对性地对高风险人群进行早筛查和早诊断。

综上所述，本研究成功筛选获得了21三体综合征可能相关的特异性代谢标志物及代谢途径。研究结果提示，T21综合征胎儿妊娠伴随着母体血清代谢物谱的变化，出现多种代谢化合物含量的显著变化，主要涉及氨基酸代谢、糖代谢、脂类代谢、多肽代谢、核苷酸代谢、血红素代谢等多种代谢途径异常。