史宜正，刘 毅，徐志鹏，傅 强

解放军总医院第一医学中心 麻醉手术中心，北京 100853

血脑屏障(biood brain barrier，BBB)是由脑微血管内皮细胞、基膜、星形胶质细胞足突以及细胞间紧密连接(tight junction，TJs)组成的重要结构。一旦遭到破坏，外界的有害物质极易进入中枢神经系统，导致中枢神经系统病变[1-3]。鉴于体内血脑屏障观察的不便性，体外血脑屏障模型对多种中枢神经系统疾病研究具有重要意义。目前已有多种建立体外血脑屏障的方法[4-5]，如体外培养单层脑内皮细胞、内皮细胞与星形胶质细胞共培养，研究表明单独培养内皮细胞的模型会丧失血脑屏障部分功能，而与星形胶质细胞联合培养则可恢复部分功能[6]，可见星形胶质细胞在诱导血脑屏障发挥特性中起重要作用。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，腹腔或局部脑室注射LPS可以促进脑内炎性因子的释放及神经元凋亡，常用来模拟中枢神经系统炎症反应[7-8]。本实验通过建立体外血脑屏障模型，并利用LPS进行处理，模拟中枢神经系统炎症反应，探究其对血脑屏障功能的影响，为进一步探究血脑屏障在中枢炎症产生机制中的作用提供思路。

材料与方法

1 实验动物 出生1 ～ 3 d C57BL乳鼠，雌雄不限，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证编号：SCXK(京)2014-0004。

2 设备与试剂 二氧化碳培养箱(MCO-170AIUVL-PC)，超净台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司)，倒置相差显微镜(德国Leica公司)，流式细胞仪(美国BD公司)，冷恒温振荡器(太仓市强乐实验设备有限公司)，上皮电阻电压仪RE1600(中国北京金工鸿泰科技有限公司 )，Mini Gel Tank(美国 Invitrogen 公司 )，电泳仪电源(DYY-5D中国北京六一仪器厂)，脱色摇床(WD-94505D中国北京六一生物科技有限公司)，化学发光仪(中国北京西冲生物科技有限 公 司 )，NuPAGETM4-12% Bis-Tris Gel(美 国Invitrogen公司 )，Transwell小室 (美国 Coring公司)，bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞(武汉普诺赛生物科技有限公司)，DMEM培养液(美国Gibco公司 )，Phosphote Buffered Saline(美国 HyClone公司)，胎牛血清(德国PAN公司)，链霉素/青霉素(美国HyClone公司)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，内皮细胞培养套装(美国Sigma公司)，DifoTMSkim Milk(美国BD公司)兔抗胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体(美国Sigma公司)，FITC标记的羊抗兔IgG(美国Jackson ImmunoReaserarch公司)，脂多糖(美国Sigma公司)，NuPAGE MOPS SDS Running Buffer(美 国 Invitrogen公 司 )，NuPAGE Transfer Buffer(美国 Invitrogen公司 )，RIPA 高效裂解液(美国Solarbio公司)，兔抗小鼠Occludin抗体(美国Abcom公司)，兔抗小鼠ZO-1抗体(美国Invitrogen公司)，兔抗小鼠GADPH抗体(美国Abcom公司)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记山羊抗兔IgG(H+L)(中国武汉博士德生物工程有限公司)。

3 bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞的培养 镜下观察bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞生长状态后置于二氧化碳孵育箱中稳定3 h以进行传代处理。吸取培养瓶中培养液，加入一定量的0.25%胰蛋白酶消化3 min。消化成功后加入等量的内皮细胞完全培养基(DMEM基础培养基+10%胎牛血清+5% PS)重悬混匀后置于离心机以1 200 r/min离心5 min。去除上清加入10 ml内皮细胞完全培养基重悬混匀后传至2个25 cm2培养瓶中，每隔2 d换液以备后续实验使用。

4 小鼠原代星形胶质细胞培养 将出生1 ～ 3 d的10只C57BL乳鼠用75%乙醇消毒全身后，断头取脑。所取脑组织放入预冷PBS中并去除软脑膜、海马及其他脑组织部分，剩余皮质部分放入新EP管内。使用1 000μl枪头反复吹打3次组织后转移至15 ml离心管内加入8 ml 0.25%胰蛋白酶，37℃恒温振荡消化30 min。完全消化后加入等量星形胶质细胞完全培养基(DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1% PS)终止消化。以1 200 r/min离心5 min后去除上清，加入完全培养基重悬后种于2个25 cm2培养瓶中。24 h后换液，此后可每2 d换液[9-10]。7 ～ 8 d后，星形胶质细胞汇聚，小胶质细胞覆盖于星形胶质细胞层之上，此时将培养瓶置于恒温摇床上180 r/min摇晃30 min。去除含有小胶质细胞的上清，换液后在孵箱稳定1 h后继于恒温摇床上续以240 r/min摇晃6 h，然后人工剧烈摇晃1 min，以去除含有少突胶质前体细胞的上清。镜下观察细胞生存状态后用胰蛋白酶消化贴壁细胞，种于新培养板内以备后续实验使用。

5 流式细胞术鉴定星形胶质细胞 通过检测胶质纤维酸性蛋白的表达以判断星形胶质细胞阳性率。待测细胞根据细胞计数结果加入PBS充分重悬后等量放于两个流式管内，一组加入兔抗胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体(1∶500)，另一组加入等量PBS，室温避光孵育30 min。一抗孵育结束后1 200 r/min离心5 min去上清，加入PBS再次重悬清洗两次。清洗结束后加入FITC标记的羊抗兔IgG(1∶100)室温避光孵育30 min。孵育结束后使用PBS清洗细胞两次后上机检测。

6 体外血脑屏障模型的建立 将上述培养的原代星形胶质细胞以2.75×104/孔的细胞密度种于Transwell小室背面，倒置培养3 h后加入500μl星形胶质细胞完全培养基并正置培养2 d后，以6.6×104/孔的细胞密度将内皮细胞种于小室内。1 ～ 2 d更换两种细胞培养基使其稳定生长待后续处理。

7 4 h液面渗漏试验 更换Transwell小室内外侧培养基，使内外侧液面相差＞0.5 cm，放置二氧化碳孵箱孵育4 h后再次测量液面差，若4 h后液面仍相差＞0.5 cm(波动浮动＜0.1 cm)，则可初步判断体外血脑屏障模型建立成功。

8 跨内皮细胞电阻(trans-epithelium electrical resistant，TEER)测定 待Transwell小室中微血管内皮细胞接种7 d后，采用中国北京金工鸿泰科技有限公司提供的上皮电阻电压仪检测TEER值，方法遵循说明书。TEER值可反映小离子通透物理屏障的电阻抗，是测定血脑屏障完整性敏感准确的指标，TEER值下降说明血脑屏障完整性下降，遭到破坏。

9 脂多糖处理方法 实验共分为三种细胞：bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞、原代星形胶质细胞和共培养模型细胞。每种细胞均分为两组：对照组和LPS处理组。每组细胞更换新鲜无血清培养基后LPS处理组以20μg/ml的药物浓度处理24 h，对照组则加入等量PBS。24 h后收集细胞待后续实验使用。

10 Western Blot检测血脑屏障相关蛋白Occludin、ZO-1相对蛋白表达量 每组细胞经LPS处理完毕后使用预冷PBS进行清洗3次，吸净所有液体后均加入100μl RIPA高效裂解液进行细胞蛋白提取，冰上裂解10 min利用细胞刮匙收集细胞，4℃12 500 g 15 min取上清。使用BCA法测定细胞浓度后，PBS稀释细胞蛋白浓度至2μg/μl。蛋白经过10 min 70℃变性冷却后备用。利用Mini Gel Tank电泳系统进行电泳，每孔上样量为10μl，电泳条件为4℃150 mA 90 min，待目的条带分离开后利用Mini Gel Tank转膜系统进行转膜，转膜条件为4℃ 250 mA 1 h。转膜成功后使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，封闭结束后使用TBST清洗PVDF膜后分别孵育三种一抗：GADPH兔抗小鼠一抗(1∶1 000)、Occludin兔抗小鼠一抗(1∶1 000)和ZO-1兔抗小鼠一抗(1∶1 000)。4℃过夜孵育后，TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG(H+L)多克隆抗体(1∶5 000)，室温孵育1 h。TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min。化学增强发光法(ECL)显色，所得条带使用Image J进行灰度值分析，以目的蛋白的灰度值与GADPH的灰度值之比半定量分析目的蛋白表达量。

11 统计学处理 使用Graphpad7.0进行统计及作图，所有数据以-x±s表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠星形胶质细胞原代培养鉴定 培养1 d后即可观察到少许贴壁细胞有粗短伸展，3 ～ 4 d后细胞即可长满60%，形态呈不规则状，胞体肥大，边界清晰，相互连接成网状。7 d后细胞可铺满呈片，经过提纯后可观察部分细胞脱落，贴壁细胞胞体较大，可呈三角形、梭形等不规则形态；突起粗短符合星形胶质细胞形态(图1)。流式细胞术鉴定后，96%细胞为阳性细胞(图2)。

图1 倒置显微镜下小鼠原代星形胶质细胞(200倍)Fig. 1 Morphology of primary astrocytes in mice under inverted microscope (200×)

2 体外血脑屏障模型建立鉴定 1) 4 h液面渗漏试验结果：4 h孵育后，Transwell小室内外侧仍可观察到明显的液面差＞0.5 cm，说明细胞层间形成屏障，初步判断血脑屏障模型建成(图3)。2)单层培养的微血管内皮细胞TEER值为(26.00±0.28) Ωcm2(n=5)，微血管内皮细胞与原代星形胶质细胞共培养模型TEER值为(34±0.82) Ωcm2(n=5)，明显高于单层培养微血管内皮细胞。

3 三种细胞分别经LPS处理后TEER测定 与对照组相比，三种细胞分别经LPS处理后TEER值均显著降低(P＜0.05)(表1)。

4 三种细胞分别经LPS处理后Occludin、ZO-1蛋白相对表达量 与对照组相比，三种细胞分别经LPS处理后与Occludin、ZO-1蛋白相对表达量均有显著降低(P＜0.05)(图4、图5)。

图2 流式细胞学分析小鼠原代星形胶质细胞纯度Fig. 2 Flow cytometry analysis of primary astrocyte purity in mice

图3 4 h液面渗漏试验前(A)、 试验后(B)结果Fig. 3 Result of liquid level leakage test at 4 h A： Before liquid level leakage test； B： After liquid level leakage test

表1 三种细胞分别经LPS处理后TEER测量结果Tab. 1 TEER measurement results of three types of cells in the control group and the LPS group (Ωcm2)

图4 Western blot检测LPS处理后三种细胞Occludin蛋白相对表达量(aP＜0.05， vs对照组， n=6)Fig.4 Relative expression of Occludin in three types of cells treated with LPS by western blot (aP＜0.05, vs control, n=6)

图5 Western blot检测LPS处理后三种细胞ZO-1蛋白相对表达量(aP＜0.05， bP＜0.01， vs 对照组， n=6)Fig. 5 Relative expression of ZO-1 in three types of cells treated with LPS by western blot (aP＜0.05, bP＜0.01, vs control, n=6)

讨 论

血脑屏障在维持中枢神经系统内环境中发挥重要作用，研究表明许多神经系统病变均与血脑屏障改变密切相关[11-12]。因而体外建立血脑屏障模型对研究中枢神经系统疾病发病机制具有重要意义。本实验将脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养于Transwell小室的培养方法构建的血脑屏障模型，更接近体内血脑屏障结构及功能，更具有临床意义。星形胶质细胞原代分离培养大多采用消化法分离[9]。本实验同样采用相同方法对星形胶质细胞进行分离，并且仅用0.25%胰蛋白酶进行消化，同时根据多次预实验结果，在消化期间采用恒温37℃振荡消化细胞而非传统水浴锅，可在一定程度上减少细菌污染的可能性，后经流式细胞术鉴定细胞纯度为96%，满足共培养要求。在动物模型中，血脑屏障通透性常利用尾静脉注射伊文思蓝后进行检测，或电镜下直接观察血脑屏障结构改变。而在建立体外血脑屏障模型时，为了可以简捷、准确判断模型是否成功，4 h液面渗透试验是较常使用方法，若4 h前后Transwell内外液面可保持基本不变，则可初步判断体外血脑屏障模型的成功建立。跨内皮细胞电阻同样可以准确、便捷地评价血脑屏障紧密连接功能，数值越大，血脑屏障功能越好[13-14]。本实验结果显示，bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞与原代小鼠星形胶质细胞构成的共培养模型TEER为(34.00±0.82) Ωcm2，而单层bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞TEER仅为(26.00±0.82) Ωcm2，可进一步说明共培养模型已成功建立。

原代小鼠星形胶质细胞、bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞及共培养模型细胞三种细胞分别经LPS处理后，与各自对照组相比，TEER值均降低(P＜0.05)说明LPS处理后引起血脑屏障功能受损。细胞间紧密连接作为构成血脑屏障的另一主要结构，通过诸多研究表明紧密连接蛋白结构、分布及含量的变化均会影响TJs，从而影响血脑屏障通透性[15]。咬合蛋白Occudin和胞质附着蛋白ZO-1则是其中两种经典且重要的紧密连接蛋白，两者相互连接形成TJs基础结构[16]。Occudin是构成TJs的基础蛋白之一，其主要是栅栏功能和细胞旁屏障功能[17]，其表达水平降低可直接破坏TJs的稳定性，导致血脑屏障功能的降低。胞质附着蛋白ZO-1同样是维持TJs结构完整稳定主要蛋白之一，其表达水平下降同样也标志着血脑屏障功能的降低[18]。本实验发现，原代小鼠星形胶质细胞、bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞及共培养模型细胞分别经LPS处理后，与对照组相比Occudin、ZO-1蛋白表达量均显著下降(P＜0.05)，进一步说明LPS处理后会破坏血脑屏障功能。

LPS作用于细胞膜表面的Toll样受体(Tolllike receptor 4)引起中枢、外周细胞因子升高同时激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，引起的体内免疫炎症反应释放大量炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF等[19-21]。多种中枢神经系统疾病如阿尔茨海默病、会不断促进炎性因子的释放，产生慢性炎症，不断损伤神经元，破坏神经系统功能[22-25]，可以说中枢神经系统炎症反应是多种神经系统疾病共同的病理生理改变，明确中枢神经系统炎症反应产生机制可以为治疗神经系统疾病提供新思路。血脑屏障作为隔绝中枢神经系统和外界的天然屏障，是否在中枢神经系统炎症反应产生中起重要作用目前无定论。根据本实验结果，组成血脑屏障微血管内皮细胞和星形胶质细胞较对照组TEER值均明显降低，Occludin和ZO-1两种血脑屏障相关连接蛋白表达量也明显下降，说明LPS诱导的中枢神经炎症反应可能首先影响这两种组成血脑屏障结构的细胞，破坏TJs完整性及稳定性，影响其生理结构后导致整个血脑屏障功能减弱，而血脑屏障功能减弱是否会加剧中枢神经系统炎症反应的进展，导致中枢神经系统疾病的产生，值得进一步研究。

总之，LPS诱导的中枢神经系统炎症反应会降低血脑屏障跨内皮细胞电阻及血脑屏障相关连接蛋白表达量，削弱血脑屏障功能。