张景禹 解万翠,2,3,4 车红霞,2 杨锡洪,2

(1. 青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266042；2. 山东省生化工程重点实验室，山东 青岛 266042；3. 青岛智科检验检测有限公司，山东 青岛 266002；4. 尚好科技有限公司，山东 青岛 266002)

金乌贼(Sepiaesculenta)墨黑色素是天然色素的重要来源，是一种高度聚合的生物大分子，存在于墨囊中，是乌贼在防御和躲避危险时喷出墨汁的主要成分，具有光保护作用[1]、抗氧化作用[2]、清除自由基[3]、金属离子螯合作用[4]、抗炎作用[5]等功能。目前，黑色素在调节免疫低下[6]、保护糖尿病肾病对肾脏损伤[7]、治疗侵袭性肺曲霉病[8]、保护急性酒精肝损伤[9]等方面具有良好的效果。

研究表明，氧化应激与糖尿病[10]、阿尔茨海默病[11]和肠道炎症[12]等慢性疾病密切相关。氧化应激可使自由基、活性代谢物(ROS)和保护机制(抗氧化剂)之间失衡[13]，损伤重要的生物分子和细胞，导致疾病。

关于墨黑色素抗氧化能力的研究多为化学法[14-16]，而在细胞水平上的功效研究鲜有报道。已有的报道[17]仅通过测定细胞增殖活性探究墨黑色素对细胞的影响，无法反应细胞内指标的变化。化学法只能简单测定抗氧化剂的抗氧化能力，不能真实模拟或反映机体内部生理环境，不能有效评价其抗氧化活性与药理作用的关系。相比于水洗、酶解、酸碱等提取法，Guo等[18]通过超声辅助方法制备可溶性黑色素，说明超声法在改善黑色素溶解性方面具有很好的效果。试验拟以金乌贼为原料，采用超声辅助法提取制备黑色素，并利用叔丁基过氧化氢诱导Caco-2细胞建立氧化应激损伤模型，同时将不同浓度的黑色素溶液加入细胞中进行提前干预，研究金乌贼墨黑色素在Caco-2细胞氧化应激损伤中的保护作用，为黑色素作为一种食补或者营养性的外源抗氧化剂的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料与试剂

冷冻金乌贼：山东青岛航海客公司；

人克隆结肠腺癌细胞Caco-2细胞：美国典型培养物保藏中心；

高糖DMEM细胞培养液：美国Hyclone公司；

胎牛血清：上海依科赛生物制品有限公司；

叔丁基过氧化氢(TBHP)：美国Sigma公司；

四甲基偶氮唑蓝(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、BCA法总蛋白定量测定试剂盒、超氧化物歧化酶SOD测定试剂盒、丙二醛MDA测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

超声波细胞破碎仪：JY92-IIN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度计：UV-1800PC型，上海翱艺有限公司；

冷冻离心机：Happy-TL18型，山东济南福的机械有限公司；

真空冷冻干燥机：FD-1A-50型，北京博医康实验仪器有限公司；

傅里叶红外光谱仪：Nicolet iS10型，赛默飞世尔科技有限公司；

扫描电子显微镜：JSM-6700F型，日本电子公司；

酶标仪：BIO-RAD680型，美国伯乐生命医学产品有限公司；

二氧化碳细胞培养箱：MCO-15AC型，日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 超声辅助提取及制备墨黑色素 参考Guo等[19]的方法并略作修改。取0.5 g干燥的黑色素样品，溶于100 mL NaOH溶液(1 mol/L)中。超声细胞破碎仪振幅80%，温度上限30 ℃，超声1 s，间歇1 s，总作用时间1 h，冷却，加入1 mol/L HCl调节pH值，8 000 r/min离心15 min，取上清液，真空冷冻干燥，得黑色素样品。

1.2.2 紫外—可见光光谱和FT-IR光谱 将黑色素样品充分溶解，配置成10 mg/L的溶液，使用紫外—可见光分光光度计在200～700 nm范围内扫描。称取0.5 mg黑色素样品，与KBr均匀混合并压制成片剂，使用傅立叶变换红外光谱仪在4 000～400 cm-1范围内扫描。

1.2.3 扫描电子显微镜和粒径统计 黑色素样品于真空喷金，通过扫描电子显微镜扫描图像，扫描电压5.0 kV/10 kV，工作距离8.4～8.8 mm。使用Nano meterer 1.2软件对黑色素粒径分布进行统计分析。

1.2.4 Caco-2细胞培养 在含有Caco-2细胞的培养瓶中加入含10%的胎牛血清(经热灭活处理)和双抗(100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)的高糖DMEM细胞培养液，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，每天更换一次培养液。待细胞贴壁生长为单层后，对其进行消化传代。

1.2.5 黑色素对Caco-2细胞存活率影响 取对数生长期的Caco-2细胞，以密度5×104Cells/mL接种至96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，置于培养箱中培养。待细胞贴壁后开始试验。试验组每孔加入200 μL样品溶液，黑色素最终浓度分别为5，20，40，60，80，100 μg/mL，每个浓度设置4个复孔，同时设置对照组，对照组为正常细胞组。继续培养24 h后，采用MTT法[19]检测，并按式(1)计算Caco-2细胞存活率。

(1)

式中：

C——Caco-2细胞存活率，%；

A1——黑色素干预组的吸光度；

A0——空白组吸光度；

A3——黑色素溶液吸光度；

A2——对照组吸光度。

1.2.6 TBHP诱导Caco-2细胞氧化损伤模型建立 取对数生长期的Caco-2细胞，以密度5×104Cells/mL接种至96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后开始试验。细胞贴壁后孵育不同浓度梯度的TBHP(0，50，100，200，300，400 μmol/L)，孵育时间4 h，MTT法检测细胞存活率，选择半抑制浓度(IC50)为后续试验作用剂量。

1.2.7 不同浓度黑色素溶液对Caco-2细胞氧化损伤的影响 细胞布板同1.2.6，细胞贴壁后分别加入5，20，40，60，80，100 μg/mL的黑色素溶液，每孔200 μL，每组5个复孔。孵育24 h后弃去上清，加入TBHP损伤4 h，MTT法检测细胞存活率。

1.2.8 细胞中SOD活性和MDA含量的测定 将Caco-2细胞以密度5×105Cells/mL接种至6孔板中。经不同浓度黑色素溶液和TBHP处理后，用PBS洗涤细胞两次，从平板上刮入到冷PBS中，采用超声波细胞破碎仪进行均质化。将匀浆液于4 ℃，5 000 r/min离心20 min，收集上清液。通过BCA分析试剂盒测定上清液样品中的蛋白质浓度，按测定试剂盒说明书进行SOD、MDA测定[20]。

1.2.9 统计学分析 所有试验重复3次，结果以(平均值±标准偏差)表示。使用SPSS 18.0和GraphPad Prism 8软件分析，采用T检验法对试验组和模型组进行统计分析和数据处理，ns表示差异无显著性，*表示P<0.05，**表示P<0.01；采用T检验法对模型组和对照组进行统计分析，##表示P<0.01；采用单因素方差分析(ANOVA)进行试验组内比较，字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 紫外—可见光光谱和FT-IR光谱

由图1可知，金乌贼墨黑色素在215 nm处有一个最大吸收峰，并且随波长的增加吸光度逐渐降低。这是由于黑色素分子中含有复杂的共轭结构，因此宽光谱范围内的强吸收和随波长逐渐降低是黑色素的典型特性[21]。此外，260，280 nm处均未观察到吸收峰，表明诸如蛋白质和脂质的杂质含量少。

由图2可知，3 420 cm-1处的强而宽的谱带为—OH和—NH拉伸振动；2 926，2 852 cm-1处的小峰和尖峰分别对应于CH3、CH2的拉伸振动；1 620 cm-1处的强吸收峰对应芳族C═C和C═O基团的拉伸振动；1 372 cm-1处的吸收峰归属于酚O—H基团的O—H变形和C—O拉伸；800～600 cm-1处的弱吸收峰表明芳香环的某些位置已被取代形成低芳族氢含量的共轭体系，与报道的真黑色素标准品[22]和天然鱿鱼黑色素[18]高度一致。其中，3 420，1 620 cm-1处的吸收峰被认为是黑色素的代表特征，说明超声辅助提取的黑色素保留了黑色素特征基团和吲哚结构。

图1 黑色素紫外—可见光谱图

图2 黑色素FT-IR光谱图

2.2 扫描电子显微镜及粒径统计

由图3可知，金乌贼墨黑色素呈纳球状，具有不同的粒径，主要分布于80～210 nm的范围内，颗粒表面轻微的凸起。黑色素单体颗粒并不代表保持其功能的最小基本单位，而只是代表一种扩展的聚集[23]。超声破碎后，黑色素部分颗粒发生形变，圆形颗粒的物理结构遭到一定程度地破坏，使黑色素产生了更小颗粒并释放更多的活性基团[18]。

图3 黑色素的显微结构

2.3 黑色素对Caco-2细胞存活率的影响

由图4可知，黑色素组的细胞存活率高于正常组，表明金乌贼墨黑色素对Caco-2细胞没有毒性，还可在一定程度上促进细胞的生长和增殖。雷敏[17]研究发现不同分子量的水溶性鱿鱼墨黑色素在48 h内显著地促进了内皮细胞的增殖。杨亚杰等[24]研究发现乌骨鸡黑色素对细胞增殖无影响。当浓度为5～100 μg/mL时，金乌贼墨黑色素干预Caco-2细胞24 h未发现毒性作用，可在此条件下进行后续试验。

图4 黑色素对Caco-2细胞存活率的影响

2.4 TBHP诱导Caco-2细胞氧化损伤模型的建立

由图5可知，当叔丁基过氧化氢浓度为0～400 μmol/L时，细胞存活率逐渐下降。当叔丁基过氧化氢浓度为300～400 μmol/L时，细胞存活率缓慢降低。当叔丁基过氧化氢浓度为400 μmol/L时，细胞存活率最低(10%)，细胞严重受损，此时叔丁基过氧化氢细胞损伤的IC50值为146.2 μmol/L。故后续采用150 μmol/L的叔丁基过氧化氢建立Caco-2细胞损伤。

图5 TBHP对Caco-2细胞存活率的影响

2.5 不同浓度黑色素溶液对Caco-2细胞氧化损伤的影响

由图6可知，叔丁基过氧化氢组的细胞存活率为59%，显著低于正常组(P<0.05)，说明采用150 μmol/L叔丁基过氧化氢能成功建立细胞损伤模型。黑色素组的细胞存活率均高于叔丁基过氧化氢组，且差异显著(P<0.05)。其中，黑色素浓度为60 μg/mL的存活率与黑色素浓度为5，20，80 μg/mL的差异显著，而与黑色素浓度为100 μg/mL的无统计学意义(P>0.05)。综上，金乌贼墨黑色素具有保护Caco-2细胞免受氧化应激诱导损伤的能力。

图6 黑色素浓度对Caco-2细胞氧化损伤的影响

2.6 细胞中SOD活性和MDA含量的测定

由图7可知，叔丁基过氧化氢能显著提升Caco-2细胞中MDA含量(P<0.05)；经40，60，80，100 μg/mL黑色素提前干预后，受损细胞中MDA含量下降，且与模型组差异显著(P<0.05)。而黑色素组间MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)。当黑色素浓度为60 μg/mL时，Caco-2细胞中MDA含量为0.933 nmol/mg·Pro，为模型组的60%。经叔丁基过氧化氢氧化损伤的Caco-2细胞中SOD酶活性显著降低(P<0.05)；而经40，60，80，100 μg/mL黑色素干预后，细胞中的SOD酶活显著升高(P<0.05)，其中，黑色素浓度为60 μg/mL的细胞中SOD酶活为39.37 U/mg·Pro，为叔丁基过氧化氢模型组的1.86倍。综上，黑色素可以通过降低细胞内不饱和脂肪酸发生过氧化反应所产生的氧化产物来降低细胞氧化损伤的程度；同时提高细胞中抗氧化物酶的活性，从而降低细胞氧化应激损伤水平。黑色素对细胞氧化损伤的保护机制可能与其他天然活性物质并不相同，但都可通过提高细胞内源性抗氧化物酶活性、降低自由基对细胞损伤来提高细胞的存活率[25]。

3 结论

以叔丁基过氧化氢诱导人克隆结肠腺癌Caco-2细胞建立氧化损伤模型，研究了金乌贼墨黑色素对Caco-2细胞氧化应激损伤的保护作用。结果表明，金乌贼墨黑色素可以通过提高Caco-2细胞中超氧化物歧化酶SOD活性和降低丙二醛MDA含量，清除过量的活性氧自由基和减少脂质过氧化程度来保护细胞免受氧化应激损伤。由于细胞氧化应激损伤的复杂性，乌贼墨黑色素的抗氧化应激损伤分子机制还需进一步研究。

图7 黑色素对叔丁基过氧化氢诱导Caco-2细胞中MDA含量和SOD活性的影响

Figure 7 Effect of melanin on MDA content and SOD activity in Caco-2 cells induced by TBHP