曹丽娜 章建浩 王晓婷魏巧云 王艺月 严文静

(1. 南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095； 2. 江苏省肉类加工与质量控制协同创新中心，江苏 南京 210095； 3. 南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095)

槟榔(Arecacatechu)因具有独特的风味口感，在湖南乃至全中国发展规模迅速。由于槟榔产品的生产加工环境开放度高、包装及从业人员手工操作，易导致槟榔成品微生物超标，这是影响槟榔产品合格率的主要原因[1-2]。目前，槟榔的杀菌研究主要集中在初生产环节，如热杀菌、SO2熏蒸、添加防腐保鲜剂等[3-4]，而关于槟榔成品的有效杀菌方法研究较少,主要有辐照杀菌、微波杀菌、脉冲强光杀菌[5-7]，但这些方法或对槟榔品质造成负面影响，或存在设备价格高、操作要求严格等问题。高压电场低温等离子体冷杀菌(cold plasma cold sterilization，CPCS)是一种新兴的食品冷杀菌技术，该技术可与气调包装完美结合，具有温升小、能耗低、无污染、无残留、作用时间短、操作简便等优点[8]，特别适用于热敏性食品的杀菌。

CPCS是在电极之间放置密封包装的样品，通过对电极施加高压，激发电极板内空气产生活性氧(ROS)、活性氮(RNS)和紫外线光子等活性成分[9-10]，这些活性成分具有良好的杀菌作用，可与样品表面微生物接触，对细胞DNA、脂质、蛋白质、细胞膜等造成损伤，从而使微生物失活死亡[11-13]。同时，这些活性成分的存留时间较短，半衰期较长的臭氧及其他活性成分在24 h内会逐渐转变为基态[14]。研究[15-16]表明，低温等离子体技术对食品具有很好的杀菌效果。Misra等[17]研究发现低温等离子体处理电压60 kV，处理草莓5 min就能有效减少草莓的菌落总数。乔维维等[18]发现介质阻挡放电低温等离子体在电压强度72 kV的条件下处理牛肉86 s，杀菌率高达93.75%。目前，关于CPCS技术用于槟榔杀菌的研究尚未见报道，试验拟以湖南散装槟榔为原材料，探究CPCS对槟榔的杀菌效果影响，在不影响其品质的基础上，优化杀菌工艺参数，为低温等离子体技术在槟榔的冷杀菌领域提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

散装槟榔：菌落总数为4.6 lg(CFU/g)左右，湖南皇爷食品有限公司；

平板计数培养基 (PCA) 、氯化钠：青岛海博生物技术有限公司；

槟榔碱标准品：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高压电场低温等离子体：CPCS-1型，南京苏曼等离子体科技有限公司；

复合气调包装机：MAP-H360型，配有气体比例检测装置，苏州森瑞保鲜设备有限公司；

电热恒温培养箱：DHP-9012型，上海一恒科学仪器有限公司；

液相色谱仪：Agilent 1260型，美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 槟榔的处理 与槟榔接触的镊子、包装盒提前用75%的酒精消毒，并于超净台中灭菌30 min。称取槟榔25 g于聚丙烯包装盒(17 cm×12 cm×3.2 cm)中，随机选取3盒，对照组为空气包装，处理组按不同因素水平气调包装后进行CPCS处理，每个处理重复3次。

1.3.2 单因素试验

(1) CPCS处理频率对槟榔杀菌率的影响：固定处理电压70.5 kV，处理时间150 s，间隔时间30 s，气体组成40% O2、30% CO2、30% N2，处理频率分别为60，70，80，90，100，110，120 Hz。

(2) CPCS处理电压对槟榔杀菌率的影响：固定处理频率100 Hz，处理时间150 s，间隔时间30 s，气体组成40% O2、30% CO2、30% N2，处理电压分别为42.5，49.5，56.5，63.5，70.5 kV。

(3) CPCS氧气比例对槟榔杀菌率的影响：固定处理电压70.5 kV，处理频率100 Hz，处理时间150 s，间隔时间30 s，固定N2比例30%，O2+CO2比例分别为10%+60%，20%+50%，30%+70%，40%+30%，50%+20%，60%+10%。

(4) CPCS处理时间对槟榔杀菌率的影响：固定处理电压70.5 kV，处理频率100 Hz，气体组成为40% O2、30% CO2、30% N2，间隔时间30 s，处理时间分别为30，60，90，120，150，180，210 s。

1.3.3 响应面法优化 在单因素试验基础上，以处理电压、处理频率、氧气比例、处理时间为自变量，杀菌率为响应值，对槟榔杀菌率进行响应曲面优化。

1.3.4 指标测定

(1) 菌落总数：样品经CPCS处理后，置于自封袋中，加入225 mL无菌生理盐水，均质器以12次/s正反面各拍打1 min，选取合适梯度的稀释液1 mL于平板，倾注灭菌冷却的PCA摇晃混合均匀，每个梯度重复3次，凝固后于37 ℃培养箱培养18～24 h。以未经CPCS处理的槟榔为对照组，按GB 4789.2—2016方法进行菌落总数计数。

(2) 杀菌率：按式(1)计算杀菌率。

(1)

式中：

Y——杀菌率，%；

N0——低温等离子体处理前菌落总数，CFU/g；

N——低温等离子体处理后菌落总数，CFU/g。

(3) 水分含量：按GB 5009.3—2016执行。

(4) 粗纤维含量：按GB/T 5009.10—2016执行。

(5) 槟榔碱含量：根据文献[19]的方法。

1.3.5 数据分析 试验结果均用Excel软件整理作图，方差分析和显著性检验采用SAS 9.4软件中GLM程序分析(P<0.05)，响应曲面试验采用Design-Expert 8.0.5软件分析作图，所有试验重复3次，结果以(平均值±标准偏差)表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 CPCS处理频率对槟榔杀菌率的影响 由图1可知，槟榔杀菌率随CPCS处理频率的增加先显著(P<0.05)升高，当处理频率>100 Hz后趋于平缓。随着处理频率的增大，等离子设备的放电功率增大，增加了高能粒子的密度，低温等离子体释放的活性物质等杀菌成分与食品微生物接触，从而杀死微生物。Takaki等[20]发现介质阻挡放电低温等离子体设备在放电过程中，随着放电频率的增大，样品空间内产生更多的活性粒子，而这些活性粒子正是杀菌的关键物质，与试验结果一致。此外，处理频率的变化决定整个体系温度的变化，虽然高频率具有更好的杀菌效果，但会使反应体系的温度升高，不适用于热敏感食品的杀菌，也不利于食品品质的保障。因此选择处理频率为90～110 Hz。

图1 处理频率对杀菌率的影响

2.1.2 CPCS处理电压对槟榔杀菌率的影响 由图2可知，槟榔杀菌率随电压强度的增大显著(P<0.05)提高。一般而言，随电压的升高，激发产生的等离子体浓度越高，产生的活性成分更多，有利于臭氧和H2O2等杀菌成分的生成，杀菌效果越明显[21]。Kim等[22]研究发现，等离子体的电压强度对猪腰肉病原菌的杀菌有显著影响，其杀菌率随电压的增高而增大。马良军等[23]研究发现电压为70，80 kV时，原始菌从8 lg(CFU/mL)分别降至6，3 lg(CFU/mL)，杀菌效果随电压强度的增大而提高。试验中在70.5 kV的试验电压下，菌落总数从4.65 lg(CFU/g)降至3.00 lg(CFU/g)，可能是因为样品的状态(固态或液态)会影响杀菌效果，液态、光滑表面的样品经CPCS处理后会产生明显的杀菌效果，而对于一些表面粗糙的样品如槟榔，达到相同杀菌效果则需更高的条件[24]。此外，样品的初始菌数越多，同等条件下CPCS杀菌效果越显著。因此选取电压为56.5～70.5 kV。

2.1.3 CPCS氧气比例对槟榔产品杀菌率的影响 目前气调包装技术常用的气体是O2、N2、CO2。气体组成会影响等离子体形成成分的组成，从而影响杀菌效果。Kim等[25]发现在纯氩气中加入一定量的氧气会使活性氧的杀菌效果更高。CO2能抑制大多数腐败细菌和霉菌生长繁殖，N2是惰性气体，一般不与食品发生化学反应，用以维持包装外形。由图3可知，当氧气比例为10%～40%时，杀菌率显著(P<0.05)升高；当氧气比例>40%时，杀菌率呈下降趋势。研究[26]表明O2有利于低温等离子体产生活性氧等活性物质，其中含氧活性成分在杀菌过程中起主要作用。马良军等[27]研究发现，低温等离子处理单增李斯特菌时，随着包装内O2浓度的提高，单增李斯特菌完全致死所需时间明显降低。当包装内O2含量较低时，激发产生的含氧活性成分量少，对微生物的致死作用不明显；逐渐提高O2浓度，叠加CO2的抑菌作用导致杀菌率逐渐上升；当O2含量过于饱和时，激发产生的活性氧等杀菌自由基量有限，即使再增大O2比例，微生物的致死率也不会有显著变化，同时CO2的抑菌作用进一步减弱，二者叠加会导致杀菌率呈缓慢降低趋势。因此，综合考虑选择O2比例为20%～60%。

图2 处理电压对杀菌率的影响

Figure 2 Effects of processing voltage on the sterilization rate

2.1.4 CPCS处理时间对槟榔产品杀菌率的影响 由图4可知，低温等离子体杀菌效果随处理时间的延长先显著(P <0.05)上升，当处理时间超过150 s后趋于平缓。Niemira等[28]利用等离子体处理苹果时，发现所有处理组的杀菌率随处理时间的增加而增加。Misra等[17]研究等离子体对樱桃的杀菌过程，发现随着处理时间的延长，杀菌率越高。Hu等[29]研究低温等离子体对大肠杆菌的杀菌过程发现，杀菌率随处理时间的延长先上升后趋于平缓，与试验结果一致。这是由于随着处理时间的延长，产生的等离子体中的活性成分浓度增大，对槟榔表面微生物的钝化效果越好；然而，当活性成分在包装内累积至一定程度时，其对样品表面微生物致死作用有限。因此选取处理时间为120～180 s。

图3 氧气比例对杀菌率的影响

图4 处理时间对杀菌率的影响

Figure 4 Effects of processing time on the sterilization rate

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面因素水平设计 根据单因素试验结果，以处理电压、处理频率、处理时间和氧气比例为影响因素，以杀菌率为指标，设计四因素三水平响应面优化试验，各因素水平表见表1，试验结果见表2。

2.2.2 回归模型建立及显著性分析 利用Design-Expert软件对试验数据进行二次多项式回归拟合分析，得杀菌率对自变量回归方程为：

Y=-1 160.82+11.21A+16.74B+1.407C+0.378D+0.073AB-6.75×10-3AC+0.013AD-4.64×10-3BC-3.8×10-3BD+1.83×10-3CD-0.084A2-0.172B2-7.68×10-3C2-4.41×10-3D2。

(2)

表1 Box-Behnken中心组合试验因素与水平

Table 1 Box-Behnken center composite test factors and level

水平A处理频率/HzB处理电压/kVC氧气比例/%D处理时间/s-19056.520120010063.540150111070.560180

表2响应面设计及结果

Table 2 Experiment design and results for response surface analysis

序号ABCD杀菌率/%1-1-10057.621-10060.73-110067.24110090.8500-1-173.16001-173.5700-1182.18001186.99-100-163.110100-168.111-100168.512100189.3130-1-1058.81401-1083.2150-11064.416011086.217-10-1065.31810-1083.719-101072.820101085.8210-10060.422010-179.8230-10173.824010190.025000088.226000085.127000087.628000086.629000084.2

2.2.3 处理频率和处理电压的交互作用 由图5可知，处理频率和处理电压的曲面倾斜程度较大，等高线呈椭圆形，表明处理频率和处理电压对杀菌率影响显著，且两因素间交互作用显著(P<0.05)，同时，处理电压比处理频率的曲面斜率更大，说明处理电压对杀菌率的影响更显著。

由表4可知，一定电压强度下，处理频率越偏离临界值，杀菌率越低。将处理频率临界值对电压进行线性回归分析可知，处理频率对低温等离子体杀菌率影响的临界值随处理电压的升高呈线性上升趋势(y=0.434x+76.445，R2=1)，且变化显著。当电压从49.5 kV上升至70.5 kV时，杀菌率从30%迅速上升至95%附近，表明杀菌率随处理电压的升高呈明显的上升趋势，当处理电压为70.5 kV时，杀菌率达最高值，与单因素试验结果基本一致。

表3 方差分析结果†

由表5可知，处理电压对等离子体杀菌率影响的临界值随处理频率的升高呈线性增大趋势(y=0.212 8x+46.459，R2=1)，杀菌率随处理频率的升高先上升后降低，当处理频率继续上升至120 Hz时，杀菌率略有降低。低温等离子体产生于密闭包装空间内，所产生的活性氧等自由基的含量在高能粒子间的复杂反应条件下，成分发生转变，因此在较高的处理频率下杀菌率反而降低，表明在实际杀菌过程中，处理频率不宜过高。

2.2.4 处理频率和处理时间的交互作用 由图6可知，处理频率和处理时间的曲面倾斜程度较大，等高线呈椭圆形，表明处理频率和处理电压对杀菌率影响显著，且交互作用明显(P<0.05)。处理频率比处理时间的响应曲面斜率更大，说明处理频率对杀菌率的影响更显著。

由表6可知，处理频率对杀菌率影响的临界值随处理时间的延长呈线性上升趋势(y=0.077 5x+95.466，R2=1)。当处理时间为150 s时，杀菌率上升趋于平缓，与单因素试验结果基本保持一致。

图5 处理频率和处理电压对杀菌率的交互作用

Figure 5 Response surface of interaction between processing frequency and processing voltage on sterilization rate

表4不同处理电压下处理频率对杀菌率影响的临界值

Table 4 The critical value of the influence of processing frequency on the sterilization rate under different processing voltage

处理电压/kV回归方程处理频率临界值/Hz杀菌率/%0.0Y=-0.084 3A2+12.89A-1 148.37376.45-49.5Y=-0.084 3A2+16.51A-778.58897.9230.0656.5Y=-0.084 3A2+17.02A-794.321100.9464.7563.5Y=-0.084 3A2+17.53A-826.910104.0285.2570.5Y=-0.084 3A2+18.05A-870.280107.0595.91

表5不同处理频率下处理电压对杀菌率影响的临界值

Table 5 The critical value of the influence of processing voltage on the sterilization rate under different processing frequency

处理频率/Hz回归方程处理电压临界值/kV杀菌率/%0Y=-0.172B2+15.984B-1 148.37346.46-90Y=-0.172B2+22.572B-671.10365.6169.44100Y=-0.172B2+23.304B-702.37367.7486.98110Y=-0.172B2+24.036B-749.46269.8790.26120Y=-0.172B2+24.768B-804.37172.0087.27

图6 处理频率和处理时间对杀菌率的交互作用

表6不同处理时间下处理频率对杀菌率影响的临界值

Table 6 The critical value of the influence of processing frequency on the sterilization rate under different processing time

处理时间/s回归方程处理频率临界值/Hz杀菌率/%0Y=-0.084 3A2+16.10A-804.62595.49-120Y=-0.084 3A2+17.66A-842.245104.7479.94150Y=-0.084 3A2+18.05A-870.280107.0595.91180Y=-0.084 3A2+18.44A-910.672109.3797.73210Y=-0.084 3A2+18.85A-955.484111.8098.26

由表7可知，处理时间对低温等离子体杀菌率影响的临界值随处理频率的上升呈线性升高趋势(y=1.473 9x+20.742，R2=1)。当处理频率为0～110 Hz时，杀菌率显著上升；当处理频率为110 Hz时，杀菌率有所降低。因此，实际杀菌应用过程中，为达到杀菌快速高效的目的，尽量选择处理时间短且处理频率不宜过高的条件。综上，当处理频率为107.05～110.00 Hz，处理时间为150.00～182.87 s时，槟榔杀菌率达最高值。

2.2.5 CPCS工艺优化 经Design-Expert软件分析可知，最佳工艺条件为处理频率108.78 Hz、处理电压69.17 kV、氧气比例44.37%、处理时间180 s，此条件下杀菌率达97.32%。考虑到实际设备操作的方便性，调整为处理频率110 Hz、处理电压70.5 kV、氧气比例40%、处理时间180 s，修正后的杀菌率为97.20%(n=3)，相对误差为0.12%，表明该模型的预测值与实际试验值吻合度高，响应面法优化结果可靠。

表7 不同处理频率下处理时间对杀菌率影响的临界值

2.3 CPCS对槟榔品质指标的影响

由表8可知，CPCS处理后对槟榔的水分含量、粗纤维、槟榔碱无显著影响(P>0.05)，表明高压电场低温等离子体杀菌处理后，对槟榔的主要品质指标无明显影响(P>0.05)。

表8低温等离子体对槟榔品质指标的影响

Table 8 Effects of cold plasma on the quality index of Areca catechu%

3 结论

高压电场低温等离子体的处理电压、处理频率、处理时间和氧气比例对槟榔杀菌影响显著(P<0.05)。处理频率的升高与处理电压、处理时间临界值的变化呈正相关(R2=1)，处理频率与处理电压、处理频率与处理时间的交互作用对槟榔杀菌率的影响显著(P<0.05)；高压电场低温等离子体处理槟榔的最佳条件为处理频率110 Hz、处理电压70.5 kV、氧气比例40%、处理时间180 s，该条件下的杀菌率为97.20%，经杀菌后槟榔碱等主要品质指标含量无明显变化。低温等离子体的杀菌效果还受空气湿度、气体流速、包装材料等因素的影响，且对不同品种的槟榔杀菌效果也不尽相同。不同空气湿度及包装材料对槟榔杀菌效果和品质的影响还有待探索。