费笑非，杜芳，张红鸭，石晓丹，张赟，燕江云，赵钢

隐球菌病是晚期HIV阳性患者最重要的机会性感染之一，其最常见的临床表现是隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitis，CM)[1]，发病率和病死率较高。在发达国家，大部分CM患者与HIV感染相关[2]。但在我国及其他亚洲国家，一半以上的CM患者免疫功能正常[3]。研究认为，这些“免疫功能正常”的CM患者可能存在影响免疫功能的潜在疾病[4]。在发达国家，HIV阴性没有接受器官移植的CM患者是死亡率最高的人群[5]。与HIV阳性患者相比，这一人群的诊断往往较晚，因此早期诊断是影响CM预后的一个关键因素。

CM的传统检测方法包括脑脊液墨汁染色涂片和脑脊液隐球菌培养[3]。脑脊液隐球菌培养是诊断CM的“金标准”，但通常需要几天时间[6]。隐球菌荚膜抗原可在血清、脑脊液和尿液标本中检测到。方法包括乳胶凝集法(latex agglutination，LA)、酶免疫法(enzyme immunoassays，EIAs)和胶体金免疫层析法(lateral flow assay，LFA)[7]。LFA敏感度和特异度最高，且成本低，速度快，已广泛应用[4]。但是人体清除荚膜多糖抗原相对较慢，即使患者脑脊液多次隐球菌涂片和培养变为阴性后，抗原检测仍可阳性，所以抗原检测是否转阴不能作为CM停药的标准[3]。与常规方法相比，分子生物学方法不仅可以诊断CM，还具有其他价值[8]。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是一种很有潜力的病原体检测方法，一次检测可以识别一系列潜在的病因——病毒、细菌、真菌和寄生虫。目前，该方法已经应用于隐球菌性脑膜炎的临床检测[9]。本研究旨在比较脑脊液墨汁染色、脑脊液隐球菌培养、LFA和mNGS等方法诊断CM的价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012年1月—2018年11月西京医院神经内科脑脊液细胞学检查室CM患者脑脊液样本47份为病例组，患者符合以下隐球菌脑膜炎诊断标准[3]：(1)有发热、头痛、脑膜刺激征等脑膜炎症状和体征，脑脊液细胞学、生化检查异常；(2)脑脊液墨汁染色和/或培养阳性。对照组为同期非CM患者脑脊液样本40份，患者符合细菌性脑膜炎、病毒性脑炎、结核性脑膜炎和自身免疫性脑炎的诊断标准[10-13]。样本均保存在-80℃冰箱中。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 隐球菌检测方法

1.2.1 脑脊液墨汁染色：将脑脊液标本离心，除去上清，沉淀物涂于干净玻片上，以墨汁染色。若在黑色背景中观察到如细胞大小且透光的物体，周围呈明亮区域，表现为典型的“星夜”现象，为阳性结果。

1.2.2 脑脊液隐球菌培养：用无菌方法将少量脑脊液接种于沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基上，37℃培养1周，有菌生长即为阳性。

1.2.3 LFA检测：将脑脊液样本离心，取上清40 μl加入试管中，滴入标本稀释液1滴，随后将胶体金试纸条放入试管中，室温孵育10 min后读取结果。试剂条包含检测条带和对照条带。2个条带都显示为阳性结果，仅显示对照条带为阴性结果。

1.2.4 mNGS检测：(1)DNA提取。提取脑脊液300 μl，使用天根生化科技(北京)有限公司生产的微量样品基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Micro DNA Kit，DP316)，按照说明书操作提取DNA。使用无脑脊液样本的无菌水作为阴性对照。(2)建库及测序。用Bioruptor Pico非接触式超声波破碎仪将提取的DNA变成200～300 bp长度的片段。添加末端修复接头，用PCR技术扩增DNA，构建文库。根据MiniSeq系统文库变性和稀释指南，按照稀释、混合、变性、再稀释、混合测序参考物PhiX(相当于DNA总量的1%)的步骤纯化文库。使用Illumina公司的MiniSeq测序仪进行高通量测序。(3)数据分析。按照Burrows-Wheeler Alignment tool (BWA)[14]算法，用计算机减去测序结果中的人源序列，将剩余的数据与微生物基因组数据库进行比对，该数据库由2 700个病毒、1 494个细菌、73个真菌和48个与人类相关的寄生虫基因组组成。并使用Soap coverage进一步处理数据，计算每个物种特异性序列数和基因覆盖度及对应的测序深度。

2 结 果

2.1 2组一般资料比较 病例组CM脑脊液样本47份来自CM患者42例，其中男26例(61.90%)，女16例(38.10%)，年龄17～88(47.5±18.6)岁。基础疾病22例(52.38%)：HIV阳性6例，系统性红斑狼疮1例，结缔组织病3例，疑似“自身免疫性脑炎”口服激素2例，慢性肾炎2例，肾病综合征3例，肾移植1例，2型糖尿病4例。47份脑脊液样本平均存放时间69～1 197 d，中位数420 d，其中未使用抗真菌药物样本29份(61.70%)，使用抗真菌药物样本18份(38.30%)。对照组40份样本分别来自细菌性脑膜炎患者7例，病毒性脑炎患者9例，结核性脑膜炎患者14例和自身免疫性脑炎患者10例，其中男20例(50.00%)，女20例(50.00%)，年龄15～74(36.8±13.8)岁。

2.2 隐球菌检测结果

2.2.1 2组墨汁染色、LFA、隐球菌培养结果比较：病例组样本47份均行墨汁染色和LFA检测，其中29份样本进行脑脊液隐球菌培养检测，结果为墨汁染色阳性24份，阴性23份；LFA阳性42份，阴性5份；隐球菌培养阳性23份，阴性6份。对照组样本40份均行墨汁染色和LFA检测，其中26份样本进行脑脊液培养检测，结果为墨汁染色和培养检测结果均为阴性，LFA阳性1份，阴性39份；脑脊液培养均阴性。见表1。

2.2.2 2组mNGS检测结果比较： 病例组脑脊液样本47份中，有39份mNGS检测到隐球菌特异性序列数(unique reads >0)。unique reads的范围为2～124 168，基因覆盖度范围为0.000 79%～31.071 1%。此外，mNGS还检测到曲霉菌1例，细菌9例和病毒4例。对照组40份样本中，有3份mNGS检测到隐球菌特异性序列数(unique reads=2)，基因覆盖度范围为0.000 82%～0.001 22%。测序深度为1。

NGS的结果受实验环境和测序试剂的影响，因此目前全世界范围内尚无统一的阳性标准，也没有特定的NGS诊断CM的阳性标准。根据真菌在DNA提取中该物种的基因覆盖度比同时检测到的其他任何真菌高出5倍的该标准[15]，病例组样本阳性35份，阴性12份；对照组40份样本均为阴性，见表1。

2.3 病例组未用药样本与用药样本阳性率比较 未使用抗真菌药物脑脊液样本29份均行墨汁染色、LFA和mNGS检测，行脑脊液隐球菌培养检测样本22份；使用抗真菌药物脑脊液样本18份均行墨汁染色、LFA和mNGS检测，行脑脊液培养隐球菌检测样本7份。未用药与用药脑脊液样本比较，mNGS和隐球菌培养的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，其他检测方法的阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4 4种检测方法的方法学指标比较 墨汁染色的敏感度、阴性预测值最高和准确度最低，LFA的敏感度、阴性预测值和准确度最高，4种检测方法的特异度和阳性预测值均接近100%，见表3。墨汁染色的敏感度和准确度与其他3种检测方法比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其他检测方法间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，仅墨汁染色与LFA的阴性预测值差异有统计学意义(P<0.05)，其他检测方法间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。4种检测方法的特异度和阳性预测值，根据Fisher确切概率法计算，相互之间差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 病例组未用药与用药样本4种检测方法阳性率比较 [%(n/n)]

3 讨 论

脑脊液墨汁染色涂片是目前CM的主要诊断方法之一，该方法操作简单，耗时较短，但受墨汁质量、操作者经验与技术水平等影响，即使采用离心浓缩脑脊液的方法，敏感度也不高[7, 16]。国内墨汁染色的敏感度为40.00%～66.67%[17-19]，低于国外报道的80.00%～93.60%，这可能与HIV阴性患者脑脊液中隐球菌量较少有关[20-23]。本研究的敏感度也较低，与国内相似。该方法所需物资设备较简单，特别适合于资源有限的地区，但其敏感度在所有方法中最低，建议临床使用墨汁染色方法时联合其他方法。

脑脊液LFA检测具有较高的敏感度和特异度，是诊断CM最敏感的方法。该方法可检测血液、脑脊液、尿液中的隐球菌抗原，且仅耗时10 min[16]。但CM患者血液和脑脊液中的荚膜抗原可能在数月至数年后仍保持阳性，因此LFA无法监测治疗的效果，更无法作为停药的标准[22]。本研究中LFA的敏感度为89.36%，略低于之前报道的95.00%～100%[20-22]。但在所有方法中敏感度最高，且成本低，速度快，所需脑脊液量较少(40 μl)，建议临床诊断CM时首选LFA检测。

表3 4种检测方法的方法学指标比较 [%(n/n)]

表4 4种检测方法的敏感度、阴性预测值和准确度比较

脑脊液培养是诊断CM的金标准，但确诊需要数天时间，最终结果可能需要1～2周。因此，使用其他诊断方法来加快诊断和治疗[24]。但CM患者脑脊液LFA和墨汁染色可长期阳性，对治疗效果没有参考价值，目前脑脊液培养阳性是确认CM复发或治疗失败的惟一检测方法[22]。本研究脑脊液培养的敏感度为79.31%，高于国内其他研究报道的25.00%～60.00%[16-17, 25]，低于国外HIV阳性患者90.00%～95.70%[20, 22, 24]。但未使用抗真菌药物标本敏感度远高于使用抗真菌药物标本(P<0.01)。该结果表明，抗真菌药物对脑脊液隐球菌培养的敏感度有显著影响。建议临床怀疑CM的患者在使用抗真菌药物前行脑脊液隐球菌培养，且判断CM复发或治疗失败时需进行脑脊液培养。

mNGS是一种无偏倚的非靶向检测方法，目前已应用于临床脑脊液病原体的检测，其优点为在脑脊液样本量有限时，可在一次试验中检测出多个潜在的病原体，还可以检测或排除合并感染，尤其对于免疫功能受损的患者有益[26]。本研究中，mNGS不仅检测到隐球菌，还检测到其他病原体。但mNGS目前尚无较大样本量的CM临床检测研究，且无统一的阳性阈值，本研究按照国内相关报道的阈值标准确定mNGS的敏感度。mNGS的敏感度低于LFA和脑脊液培养，可能有以下原因：(1)文献报道，脑脊液样本存放时间较长，经历多次冻融循环和使用抗真菌药物可能会降低mNGS的敏感度[26]。本研究病例组样本平均存放时间较长，且未使用抗真菌药物标本敏感度高于使用抗真菌药物标本(P<0.05)。(2)Schlaberg等[27]的研究提出，临床为减少mNGS假阳性，故意设定保守的阈值，应该为临床明确的病原体设立比临床意义不明且环境中存在的病原体更宽松的报告阈值[26]。按照目前的阈值标准，敏感度较为保守。因此，当患者有免疫功能受损或脑脊液样本有限时，建议临床在使用抗真菌药物前及时进行mNGS检测。

本研究有一定的局限性：(1)为回顾性研究，脑脊液样本冻存时间较长，影响mNGS结果的准确性。(2)虽然比较了传统方法和mNGS检测CM临床脑脊液本的敏感度和特异度，但样本量较少，且目前的阈值较保守，需用大样本前瞻性的研究，进一步探究mNGS检测的截断值、敏感度和特异度。(3)mNGS对抗真菌药物较为敏感，需用大样本前瞻性的研究，进一步判断mNGS是否可用于监测CM的治疗效果和判断CM复发或治疗失败。

综上所述，LFA的敏感度最高，建议临床首选；墨汁染色操作简单但敏感度较低，需与其他方法联合使用；隐球菌培养和mNGS对抗真菌药物敏感，需在使用抗真菌药物前进行检测。mNGS是一种较为敏感的检测病原体的方法，可用于CM的早期诊断，还可以检测或排除合并感染。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

费笑非、赵钢：设计研究方案，实施研究过程，设计论文框架，撰写论文；杜芳：提出研究思路，指导研究设计；张红鸭、石晓丹：进行文献调研与整理，修订论文、论文审核；张赟、燕江云：数据收集，分析整理