李鑫娜 申辛欣 王瑞白 段素霞 张瑞卿 王瑞欢 白雪丁 凡国豪 王金荣 高源 陈子巍 马学军

利福平作为一线抗结核药物，主要通过与细菌的RNA聚合酶的β亚单位结合，干扰细菌的RNA转录，从而发挥杀菌作用。编码RNA聚合酶β亚单位的基因(rpoB基因)中有一段长81 bp的利福平耐药决定区(rifampin resistance-determining region, RRDR；密码子507～533，共27个氨基酸)，超过95%的利福平耐药MTB菌株在该区域内发生突变，而密码子516、526和531是最常见的突变位点[1]。

目前，核酸检测技术更迭迅速，使得MTB分子生物学药物敏感性试验(简称“药敏试验”)技术发展迅速，例如，聚合酶链反应-单链构象多态性方法(PCR-SSCP)[2]、荧光定量PCR方法[3]、高分辨率熔解曲线法[4-5]、反向探针杂交方法[6]、基因芯片技术[7-8]等。这些方法和技术虽结果准确，但需要专业人员进行操作，且实验对仪器设备依赖性较高，需要高精密仪器。重组酶介导等温扩增法(recombinase aided amplification, RAA)是一种适合现场和基层的等温核酸扩增方法。该方法操作简便，可利用便携式仪器快速进行病原微生物检测[9-10]。笔者实验室曾建立探针导向的重组酶介导的等温扩增法(probe-directed recombinase amplification，PDRA)，并成功应用于5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)A1298C的单核苷酸多态性(SNP)位点检测[11]。本研究中，笔者拟探究采用PDRA方法检测MTB的rpoB基因516位点突变的应用价值。

材料和方法

1.菌株来源：6株MTB利福平耐药菌株、35份MTB培养阳性的痰标本均来自中国疾病预防控制中心传染病所结核病室。

2.细菌基因组制备：采用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)方法进行细菌基因组提取[12]。方法简述如下：80 ℃灭活30 min，离心弃上清，菌体沉淀用400 μl TE缓冲液旋起，加入溶菌酶，37 ℃孵育16～20 h。加入10% 十二烷基硫酸钠(SDS)/蛋白酶K混合液，65 ℃孵育10 min，加入氯化钠(NaCl)和CTAB/NaCl混合液，65 ℃孵育10 min，加入氯仿/异戊醇混合液，离心并转移上清，加入0.6倍体积异丙醇以沉淀DNA，-20 ℃放置30 min，离心弃上清，用1 ml 70%冰乙醇洗涤DNA沉淀；离心并且干燥，用TE缓冲液溶解DNA。

3.标准质粒制备：质粒合成由北京擎科生物技术有限公司完成，包括1种野生型(TB-516-GAC，即TB-516-W)和3种516位点单点突变型(TB-516-GGC突变、TB-516-GTC突变、TB-516-TAC突变)。片段长度为960 bp的rpoB基因，其中包含81 bp 的RRDR决定区。

4.仪器与试剂：RAA 荧光检测仪QT-7200、RAA荧光基础试剂盒均购自江苏奇天基因生物科技有限公司，引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

5.引物和探针设计：通过NCBI下载rpoB基因序列，在516位点附近设计探针和引物，避免出现二级结构及形成引物二聚体。设计1条野生型探针、3条突变型探针、1条反向引物。探针长46～52个碱基，3′端采用C3-spacer阻断，荧光基团和淬灭基团标记在中间相邻近的T碱基上，突变点位于四氢呋喃(THF)的5′端。具体序列见表1。

6.PDRA 扩增体系及条件：参照文献[11]，516位点常见突变包括3种类型(GGC、GTC、TAC)，需配制4种反应体系，分别检测野生型及3种突变型。4种检测体系的引物组成如下：TB-516-W检测体系为P-W和R，TB-516-GGC检测体系为P-GGC和R，TB-516-GTC检测体系为P-GTC和R，TB-516-TAC检测体系为P-TAC和R。以TB-516-W检测体系为例，总体积50 μl，包括300 nmol/L正向探针(P-W)，420 nmol/L反向引物(R)以及1×缓冲液。向装有干粉的反应管中加入上述混合液和2 μl模板DNA，并将2.5 μl醋酸镁(280 mmol/L)加入管盖内，盖上管盖，混匀离心使醋酸镁进入扩增体系。其他检测体系配制同上，只需进行探针替换即可。将上述反应管放入QT-7200荧光检测仪中，39 ℃反应40 min，实时收集荧光。通过比较检测样品在4种反应体系的扩增时间差异来判断是否发生突变及突变类型。

表1 PDRA方法的探针及引物

注标注下划线的碱基为516突变点

图1～4 PDRA方法特异度检测。图1为4种检测体系分别扩增2×105拷贝野生型质粒情况，可见TB-516-W体系的阳性阈值时间早于其他体系。 图2为4种检测体系分别扩增2×105拷贝 TB-516-GGC突变型质粒情况，可见TB-516-GGC体系的阳性阈值时间早于其他体系的阳性阈值时间。图3为4种检测体系分别扩增2×105拷贝 TB-516-GTC突变型质粒情况，可见TB-516-GTC 体系的阳性阈值时间早于其他体系的阳性阈值时间。图4为4种检测体系分别扩增2×105拷贝 TB-516-TAC突变型质粒情况，可见TB-516-TAC体系的阳性阈值时间明显早于其他体系的阳性阈值时间

图5～8 PDRA方法敏感度检测。图5为TB-516-W体系检测1010～103拷贝/μl野生型质粒。图6为TB-516-GGC体系检测1010～103拷贝/μl TB-516-GGC突变型质粒。图7为TB-516-GTC体系检测1010～103拷贝/μl TB-516-GTC突变型质粒。图8为TB-516-TAC体系检测1010～103拷贝/μl TB-516-TAC突变型质粒

7.PDRA方法的特异度和敏感度检测：4种类型的质粒，包括一种野生型和3种突变型质粒，作为模板进行特异度实验；分别将质粒10倍稀释为1×1010～1×103拷贝/μl用以敏感度检测实验，以无核酶水作为阴性对照，重复3次独立实验并记录实验结果，以3次均可检测出的最低拷贝数浓度作为检测敏感度。

8.方法测试：(1)菌株测试：对MTB利福平耐药菌株，采用CTAB法提取基因组，经PCR后进行测序[13]，同时用本研究建立的检测516位点的PDRA方法进行测试。(2)临床标本测试：经培养后的痰液临床标本，采用CTAB法提取基因组，经PCR后进行测序[13]，并且进行516位点的PDRA方法测试。

结 果

1.PDRA方法特异度：通过4种检测体系分别检测4种不同类型的质粒，只有检测探针与检测模板完全匹配的检测体系，阳性阈值时间最早，相对荧光强度值最高；而其他扩增体系的阳性阈值时间滞后或者荧光值低。图1～4显示了4种检测体系检测2×105拷贝质粒的情况。当检测体系的探针与模板为相互对应关系时，阳性阈值时间最早；当检测体系的探针与模板不是对应关系时，则表现为阳性阈值时间滞后。检测体系TB-516-W、TB-516-GGC、TB-516-GTC和TB-516-TAC的阳性阈值时间差值分别为7.0、5.8、10.0、7.0 min。4种检测体系稳定，在检测不同浓度的模板时，拥有相对稳定的阳性阈值时间及时间差值。

2.PDRA方法敏感度：4种检测体系分别检测对应类型的质粒DNA(1010～103拷贝/μl)，从而确定PDRA方法的敏感度，如图5～8所示，在40 min内，4种检测体系的敏感度均可达到1000拷贝/μl。

3.菌株测试结果：采用PDRA法及测序法检测6株利福平耐药MTB，6株MTB经测序后发现有3株发生516位点突变，3株发生526位点突变，1株发生531位点突变，其中1株发生了双位点突变(菌株T5)，PDRA方法检测各菌株516位点的结果与预期结果一致，可正确区分是否发生516位点突变，并且可确定516位点突变类型。具体表现为516位点突变的菌株，PDRA检测结果显示突变型体系阳性阈值时间早于野生型体系，而突变类型不同，则对应体系的阳性阈值时间更早(图9～11)；而对于非516位点突变菌株，PDRA检测结果显示野生型体系的阳性阈值时间更早(图12～14)。

图9～14 PDRA法及测序法检测MTB菌株结果对比。图9为MTB菌株HN05021(516-GGC突变)检测结果。图10为MTB菌株HeN05046(516-GTC突变)检测结果。图11为MTB菌株T5(516-TAC，526-GAC突变)检测结果。图12 为MTB菌株T7(516-W，526-TAC 突变)检测结果。图13为MTB菌株T4(516-W，526-CGC突变)检测结果。图14为MTB菌株FJ-14011(516-W，531-TTG突变)检测结果

4.临床标本测试结果：35份痰标本，经测序后确定有8份(22.9%)在rpoB基因RRDR决定区发现点突变，其中2份(5.7%)发现516位点突变(GGC、GTC)，1份(2.9%)发现526位点突变，5份(14.3%)发现531位点突变。针对516位点的PDRA方法检测标本的实验结果与预期结果一致，可识别516位点有无突变，以及发生突变的类型。标本检测结果示例见图15～18，如图15、16所示：2份516位点突变标本经PDRA测试，表现为对应的突变型体系阳性阈值时间早；如图17、18所示： 531位点突变标本及野生型标本经PDRA测试，表现为野生型体系的阳性阈值时间早。

图15～18 PDRA法及测序法检测MTB培养阳性痰标本结果对比。图15为标本181030(516-GGC突变)检测情况。图16为标本181076(516-GTC突变)检测情况。图17为标本181059(516-W，531-TTG突变)检测情况。图18为标本181034(野生型)检测情况

讨 论

本研究应用PDRA法检测MTB利福平耐药基因rpoB基因的516突变位点，通过设计特异性探针识别单个碱基，利用单引物和单探针进行扩增，借助便携荧光检测仪判断该位点是否发生突变。因rpoB基因516位点常出现3种突变类型(GGC、GTC、TAC)，所以设计4条特异性探针(1条野生型探针和3条突变型探针)和1条共同的反向引物，建立4种平行检测体系检测模板，在恒温39 ℃条件下反应40 min，依据阳性阈值时间早晚进行516位点突变点识别。不同检测体系在检测相同模板时，阳性阈值时间不同，只有体系的探针与模板完全匹配时，其阳性阈值时间最早，相对荧光强度值最高；而体系的探针与模板不匹配时，则阳性阈值时间晚，荧光值低。通过4种体系检测同一类型的重组质粒，确定了该方法的特异度；通过系列稀释的重组质粒，确定了该方法的检测敏感度为1000拷贝/μl。该方法与测序法同时检测利福平耐药菌株及痰标本， 所得结果一致。

目前已有将RAA方法应用于MTB和非结核分枝杆菌检测的研究。陈淑丹等[14]应用RAA方法检测3种非结核分枝杆菌(海分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌)，检测下限可达1000拷贝/μl质粒DNA。陈斌等[15]应用RAA方法检测MTB，最低敏感度为0.043 ng/μl MTB基因组DNA，与其他呼吸道病原菌无交叉反应。两项研究侧重于病原体的定性检测，不涉及耐药突变位点的检测。而本研究的侧重点是已知MTB感染的前提下，进行MTB利福平耐药基因突变位点检测。在PDRA检测体系优化过程中，笔者借鉴等位基因特异性PCR(AS-PCR)的3′端错配原则，在探针的突变位点的5′方向加入人为错配碱基，但检测结果与预期相反，其区分度反而下降。分析可能的原因是RAA的扩增原理与PCR的扩增原理不同：RAA体系主要依赖重组酶与引物或探针形成核酸蛋白复合物，扫描模板，找到同源序列后可解开双链，启动延伸反应；而PCR则是通过温度循环保证扩增反应(变性-退火-延伸)顺利进行。在RAA体系里，序列同源性是非常重要的，引入人为错配碱基，降低了同源性比例，反而降低了探针的特异度。笔者曾尝试加入甜菜碱来提高特异度，但实验结果表明，加入甜菜碱后在某些检测体系(TB-516-GTC)中表现为促进作用，而某些检测体系(TB-516-GGC)则表现为抑制作用。这种拮抗作用的具体机制未明。为了保证检测体系的一致性。本次研究选择不加甜菜碱。

综上，本研究建立了一种检测MTB利福平耐药rpoB基因516突变位点的等温核酸扩增方法，该方法具有以下特点：(1)39 ℃恒温反应，无需精密PCR仪，只需一台便携式荧光检测仪；(2)检测快速，检测可在40 min内完成；(3)闭管操作，不易造成交叉污染；(4)检测结果通过荧光曲线有无及阳性阈值时间进行判定，直观易判断。本研究作为一个初步研究，证明PDRA方法可以应用于MTB利福平耐药基因位点突变的检测。但本研究也存在一些不足：造成利福平耐药的常见rpoB基因突变类型有3种，包括531位点、526位点及516位点[1]，而笔者本次研究只建立了针对516位点的PDRA检测方法，后续还将进一步补充526、531位点的PDRA检测方法，并收集更多的测试标本完成方法学评估。