凌志洲，夏雨，曾荣，鲁旺旺，白卫东，白永亮，，*

（1.佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山528000；2.咀香园健康食品（中山）有限公司，广东中山528437；3.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

青梅（Prunus mume Sieb.Et Zucc），俗称酸梅、果梅或干枝梅，属蔷薇科李属，多年生落叶果树，属于药食两用果品[1]；果肉中含有多种谷甾醇、抗菌性多酚、黄酮类、有机酸、维生素以及钾、钙、铁、磷、锌等矿物质；同时富含18种氨基酸，其中8种为人体必需氨基酸[2-5]。青梅最大营养特色是含有丰富而优质的有机酸，含量一般在3.0%～6.5%，远高于一般水果，且糖含量较低，其T值（糖酸比）仅为0.2，是梨的1/70，杏的1/8，比柠檬的T值还低[6]。其所含的有机酸主要为柠檬酸、苹果酸、单宁酸、苦叶酸、琥珀酸、酒石酸等[7-8]，具有生津解渴，改善消化不良、食欲不振等症状；且具有消除疲劳、改善碱性体质、促进皮肤角质层代谢、防止皱纹、抗肿瘤、改善肠胃功能、抗菌、抗过敏、保护肝脏等功效[9-13]，在医药领域和食品领域都得到了广泛的应用。

但由于青梅略带苦涩的口感欠佳，在我国极少鲜食，多见用于开发传统的初级加工制品，例如苷草梅、话梅和酥梅等，延长货架期。近年来，利用青梅开发的深加工产品较少，主要是青梅酒[14]，还有包括青梅果脯、青梅酸奶、青梅汁、青梅果冻等[15-18]，未见针对于青梅特征成分丰富的有机酸的开发利用报道。根据王玉霞等[19]研究报道，新鲜青梅的含水量高达88%以上，同时新鲜青梅有机酸含量为6%左右，直接用于提取制备富含青梅有机酸的青梅香酊等深加工产品工艺难度较大。目前对青梅有机酸的提取工艺研究报道也较少，只有鲁旺旺等[20]采用低温酶解辅助乙醇浸提法提取了经微波处理干制后青梅果肉中的有机酸，尚未见关于超声波辅助浸提青梅中有机酸的研究报道。对于绝大部分水果而言，由于香味挥发性物质含量较低，无法实现水油两相的分离，存在于水相中的香味挥发物无法直接用于香精的调配。因此，如何控制提取工艺，进而进行香味成分分离浓缩，是调配水果香韵香精必须解决的一个问题。

本试验采用经微波干燥处理后的干制青梅果肉为原料提取青梅有机酸，运用超声波技术辅助提取，制得有机酸含量高和香气成分保留率高的青梅有机酸提取液，并采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC） 和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）分析对提取液中有机酸和香气特征成分进行分析。该产品可以进一步浓缩制备青梅香酊，或用于各类食品中，具有良好的开发前景，使青梅深加工产业得到进一步的发展。

1 材料与方法

1.1 原料与设备

青梅：微波干燥产品，四川绵阳天众中药材有限公司；果胶酶（Pectinex XXL，酶活力 10 000 U/mL）、纤维素酶（酶活力561.7 U/mL）：诺维信（中国）生物技术有限公司。

LC-10AT高效液相色谱仪：日本岛津；TRACE GCMS气质联用仪：美国Finnigan公司；SHZ-D（Ⅲ）防腐台式循环水真空泵：上海卫凯仪器设备有限公司；SB-400 DTY超声波仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；752N紫外可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.1.1 乙醇回流工艺

干制青梅果肉→粉碎过筛→乙醇回流提取→抽滤→有机酸测定。

提取条件为：回流时间4 h，乙醇浓度70%，料液比 1 ∶10（g/mL），回流温度 85℃[20]。

1.2.1.2 超声提取工艺

干制青梅果肉→粉碎过筛→酶解→超声波提取→抽滤→有机酸测定。

1.2.2 超声波提取工艺的单因素条件分析

1.2.2.1 超声时间对有机酸提取效果的影响

取5 g干制青梅粉加入适量水50℃酶解1 h，后加入70%乙醇，料液比1∶10（g/mL），摇匀置于超声波仪中，超声功率320 W，超声温度30℃，分别超声提取0、10、20、30、40 min，测定不同超声提取时间对总有机酸得率的影响。

1.2.2.2 超声功率对有机酸提取效果的影响

取5 g干制青梅粉加入适量水50℃酶解1 h，后加入70%乙醇，料液比1∶10（g/mL），摇匀置于超声波仪中，依次调节超声功率 0、80、160、240、320、400 W，超声温度30℃，分别超声提取20 min，测定不同超声功率对总有机酸得率的影响。

1.2.2.3 超声温度对有机酸提取效果的影响

取5 g干制青梅粉加入适量水50℃酶解1 h，后加入70%乙醇，料液比1∶10（g/mL），摇匀置于超声波仪中，超声功率 320 W，超声温度依次为 30、40、50、60、70、80℃，超声提取20 min，测定不同超声温度对总有机酸得率的影响。

1.2.2.4 超声料液比对有机酸提取效果的影响

取5 g干制青梅粉加入适量水50℃酶解1 h，后加入 70%乙醇，依次调节料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），摇匀置于超声波仪中，超声功率320 W，超声温度为30℃，超声提取20 min，测定不同超声料液比对总有机酸得率的影响。

1.2.3 正交试验优化

在单因素试验基础上，将干制青梅粉加入适量水50℃酶解1 h，后加入70%乙醇，摇匀置于超声波仪中，选用四因素三水平的正交试验方案，确定有机酸提取的最佳工艺参数。其因素、水平设计见表1。

表1 正交试验参数及水平Table 1 Orthogonal test parameters and levels

1.3 测定方法

1.3.1 干制青梅果肉总有机酸含量的测定

干制青梅果肉总有机酸含量的测定参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》。

1.3.2 HPLC测定青梅有机酸提取液成分分析

取两种不同方式的青梅有机酸提取液，经5000r/min离心10 min，上清液用0.45 μm孔径滤膜过滤，滤液进行HPLC分析。色谱柱条件：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A（甲醇），B（0.01mol/L KH2PO4（pH2.85）水溶液）；流速：0.8 mL/min；检测波长：215 nm；温度：20℃；进样量：10 μL。8种有机酸标准样品色谱图如图1所示，回归分析和检出限如表2所示。

1.3.3 GC/MS测定青梅有机酸提取液香气分析

图1 8种有机酸标谱Fig.1 Standard chromatogram of 8 organic acids

表2 8种有机酸回归分析和检出限Table 2 Regression analysis and detection limit of 8 organic acids

色谱条件：弹性石英毛细管柱上DB-5（30 m×0.25 mm）；程序升温，柱温起始温度45℃进样后停5 min，然后以5℃/min升至80℃停5 min，然后再以5℃/min升至200℃，进样口温度200℃；载气为高纯氦气，流量为1.0 mL/min。

质谱条件：EI源，源温230℃，加速电压6 kV，电子能量 70 V，源真空 5×10-4Pa，分析器真空 1×10-6Pa。质量分析器四极杆150℃，扫描质量数m/z 35～335，扫描时间15 s，回扫时间0.025 s。取1 μL制备好的样品进色谱，进行GC/MS分析。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助提取工艺单因素试验

2.1.1 超声时间对提取效果的影响

超声时间对提取效果的影响见图2。

图2 超声时间对提取效果的影响Fig.2 The influence of ultrasonic time on the extraction effect

由图2可知，超声时间从0到20 min青梅果肉（干重）总有机酸得率逐渐提高，20 min时得率最高提取效果最好；20 min后随着时间的延长得率略有下降，但差异不显著，与庞荣丽等[21]研究结果相似。由于超声波作用时间的增加导致溶剂温度上升，增加其他成分的溶解，延长提取时间会产生大量残渣，不易过滤，影响总有机酸的提取得率及进一步的分离。且考虑到提取周期，选择20 min为最佳提取时间。

2.1.2 超声功率对提取效果的影响

超声功率对提取效果的影响见图3。

图3 超声功率对有机酸提取效果的影响Fig.3 The effect of ultrasonic power on the extraction of organic acids

由图3可得，超声功率低于320 W时，总有机酸得率随着超声功率的增大而增大；当功率高于320 W时，得率整体趋于平缓。提取包括扩散、渗透、溶解等过程，提取功率愈大，提取愈完全，但当扩散达到平衡时，增大超声功率，得率不再增大[22]，故选择320 W为最佳超声功率。

2.1.3 超声温度对提取效果的影响

超声温度对提取效果的影响见图4。

图4 超声温度对提取效果的影响Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on the extraction effect

由图4可得，温度对总有机酸得率的影响较明显。研究表明，随着温度升高液体介质的表面张力和黏度降低，而液体的蒸汽压则增加，这样在液体介质之间很容易拉开而形成空化气泡，从而在较低超声波强度下即可产生空化作用[23]。空化作用使得细胞破坏程度增大，促进细胞内部的有机酸物质向外扩散。试验结果表明，随着温度升高总有机酸得率迅速提高，在60℃时有机酸得率达到最高；高于60℃后，总有机酸得率不再显著提高。同时可能随着温度的升高青梅的香气损失就会增大，由此选取60℃为最佳超声温度。

2.1.4 不同料液比对提取效果的影响

料液比对提取效果的影响见图5。

图5 料液比对提取效果的影响Fig.5 The influence of liquid ratio on extraction effect

由图5可得，随着提取溶剂体积增大，总有机酸得率呈先显著提高后缓慢降低的趋势，当料液比为1∶10（g/mL）时得率最高。可能因为加入的溶剂量少，作为超声波介质的液体量不足，导致提取效果较差；随着提取溶剂量的增大，细胞内部的有机酸开始向外扩散，此时总有机酸的得率也随之增大。当料液比在1 ∶10（g/mL）～1 ∶25（g/mL）之间时，总有机酸得率呈下降趋势，但趋势不明显。考虑到提取的溶剂量过大时会增加后续浓缩处理的工作量和能耗，不利于实际操作和生产，从成本考虑选定1∶10（g/mL）为最佳提取料液比。

2.2 正交试验优化结果

超声波辅助提取青梅有机酸正交试验优化结果及方差分析见表3和表4。

表3 超声波辅助提取正交试验结果Table 3 Ultrasonic extraction of orthogonal test results

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis table

表3结果表明，超声时间对干制青梅果肉总有机酸得率的影响程度最大，超声功率次之，超声温度和料液比的影响较小；最佳提取条件为A2B2C3D3，即超声温度为70℃，超声功率320 W，超声时间为20 min，料液比1∶15（g/mL）。为进一步判断4个因素对试验结果的影响是否显著，对正交试验结果数据进行方差分析。由表4可以看出，超声时间、超声功率对青梅中有机酸提取效果影响显著。

为了验证正交试验的可靠性，根据实际情况采用最优工艺条件（超声时间20 min，超声温度70℃，超声功率320 W，料液比1∶15（g/mL））进行验证试验。经过3次平行试验，实际总有机酸提取得率的平均值为35.07%，与正交试验表中最大值接近，表明该提取工艺基本稳定、可行。相比乙醇回流提取总有机酸得率（31.2%）显著提高，与鲁旺旺等[20]采用酶解法提取有机酸得率相比，没有明显差异，但超声提取的时间比酶解浸提大大缩短。

2.3 青梅提取液中有机酸和香气成分分析

青梅提取液的特色之处在于其含有丰富的有机酸和天然独特的果香味，可以将有机酸和其天然香气作为衡量产品的主要指标。本文以传统乙醇回流提取工艺作为对比，研究超声波辅助提取工艺对有机酸和香气成分的影响。

2.3.1 有机酸成分分析

乙醇回流及超声辅助提取青梅提取液中主要有机酸的含量见图6和图7。

图6 不同工艺提取液中主要有机酸的含量Fig.6 Main organic acid content of different extract

图7 不同工艺提取液中主要有机酸含量Fig.7 Main organic acid content of different extract

试验对青梅提取液中8种主要有机酸的含量进行测定。由图6和7可得，青梅有机酸中以柠檬酸和苹果酸为主，这与Yu等[24]的研究结果一致。超声辅助提取液中柠檬酸和苹果酸含量显著高于乙醇回流提取，可能是由于这两种有机酸受温度影响较大所致[25]。乙醇回流提取液中易挥发的乳酸和乙酸损失严重，基本检测不出。试验结果表明，超声波辅助提取工艺对青梅主要有机酸种类保留较好，总有机酸得率较高，提取效果最好。

2.3.2 香气成分分析

乙醇回流及超声辅助提取青梅提取液中香气成分GC/MS分析结果见表5，及其不同种类的香气百分含量见图8。

表5 提取液香气成分GC/MS分析结果Table 5 GC/MS analysis results of extract aroma composition

续表5 提取液香气成分GC/MS分析结果Continue table 5 GC/MS analysis results of extract aroma composition

图8 两种提取液主要香气种类的比较Fig.8 Comparison of the main aroma types of three extracts

从表5统计结果可见，乙醇回流提取液香气成分鉴定出37种，超声辅助提取液中香气成分也鉴定出37种，但各种香气的成分含量存在显著差异。与青梅汁和青梅酒等产品相比，青梅有机酸提取液的香气种类更为丰富[26]。提取液香气成分含量较高的是一些酸类，主要是棕榈酸、亚油酸、衣康酸酐、柠檬酸等，这些酸类物质赋予青梅独特的酸香味。在香气种类方面，乙醇回流提取液共检测出酸类7种，脂类11种，醇类3种，醛类5种和烷烃5种；超声辅助提取液共检测出酸类14种，脂类4种，醛类5种和烷烃5种。

由图8可知，超声辅助提取液中酸类等香气成分相对含量显著高于乙醇回流提取液，特征香气亚油酸和棕榈酸等相对含量都有较大程度的提高，香气成分保留率明显较好。乙醇回流提取液香气种类也比较丰富，特别是酯类，但相对含量较少，这可能因为在长时间的加热回流条件下，一些有机酸和醇酯化生成了一些酯类香气，从而改变了提取液天然的香气成分。醛类和酯类物质作为新鲜青梅主要的呈香物质[27]，相比乙醇回流提取，超声辅助提取能较好的保留酯类和醛类物质。而相对于新鲜青梅，提取液中酯类物质的减少，可能是在干燥或提取过程中分解生成了醇类和酸类导致。

3 结论

本试验采用正交试验优化超声波辅助提取工艺，结果表明超声时间和超声功率对干制青梅果肉总有机酸得率的影响程度最大，超声温度和料液比的影响相对较小。确定最佳提取条件为：超声温度70℃，超声时间 20 min，料液比 1∶15（g/mL），超声功率 320 W。在此条件下干制青梅果肉总有机酸提取得率为35.07%，相比传统乙醇回流提取总有机酸得率（31.2%）显著提高。

由HPLC分析8种有机酸结果可知，干制青梅果肉提取液有机酸种类以柠檬酸和苹果酸为主，成分流失较少；相比乙醇回流提取，超声辅助提取有机酸的种类和含量更多，乙醇回流提取液中易挥发的乳酸和乙酸基本鉴定不出，超声辅助提取能很好的保留柠檬酸（33.06%）和苹果酸（2.038%）。由GC/MS分析结果可知，提取液主要特征香气成分为酸类物质，酯类和醛类物质含量次之；超声辅助提取液特征酸性香气的含量显著高于乙醇提取液。