陈家宇，李嘉仪，窦勇，*，吴琳，任虹烨，闫永芳，周文礼，于士国

（1.天津农学院天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384；2.天津蕴华农业科技发展有限公司，天津 301823）

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种单细胞微藻，在分类学上隶属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。细胞宽约 19 μm～51 μm，长约28 μm～63 μm，生殖方式为单细胞孢子生殖或合子生殖。雨生红球藻的生活史呈现多样性，但主要分为游动阶段细胞和不动阶段细胞两种状态。游动阶段细胞呈卵圆形或椭圆形，细胞运动依靠两条顶生、等长的鞭毛，这一阶段的细胞大多呈绿色，偶尔也呈红色；不动阶段细胞呈圆形，没有鞭毛不能运动，主要呈现红色，在此阶段微藻细胞开始逐渐合成并积累虾青素。雨生红球藻细胞内虾青素含量占到干重的1.5%～10%，因此被公认为自然界中生产天然虾青素的最佳生物[1]。2010年11月11日国家卫生部批准将雨生红球藻纳入新资源食品目录，成为少数几种获得国家认可的食品级微藻。在水产养殖领域雨生红球藻同样有着广泛应用，由于粒径适中、营养丰富常用作鱼虾育苗的开口饵料。另外雨生红球藻在生长过程中会产生碱性物质，可以有效中和养殖水体的酸度，起到调节水质维持环境健康的作用，因此是水产养殖过程中最常用的植物性生物饵料之一[2]。

虾青素（Astaxanthin）是一种脂溶性类胡萝卜素，属于萜烯类不饱和化合物，分子式为C40H52O4。虾青素最早是从水产动物组织、螯虾外壳及海藻细胞中发现，是目前为止在自然界有机体中发现的抗氧化能力最强的物质，它清除自由基和单线态氧淬灭的能力远远高于维生素E，比玉米黄质、番茄红素及β-胡萝卜素等常见抗氧化物质的抗氧化能力也要高10倍以上，因此虾青素具有抑制肿瘤、提高肌体免疫力、清除活性氧和自由基等作用[3-4]。此外虾青素还有良好的着色效果，可以进入生物体并贮存在组织中，使某些动物的肌肉和皮肤呈现鲜亮的颜色（如红鳝鱼、大马哈鱼等）[5]，我国农业部318号文中指定天然虾青素为水产动物唯一着色剂。另外虾青素在在食品、保健品、药品、化妆品等领域都有很好的应用前景。

本研究利用试验生态学方法，探索了光照强度、NaNO3和NaCl浓度对雨生红球藻光合作用和积累虾青素的影响，为雨生红球藻作为“生物反应器”高产虾青素提供一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

KOH、甲醇、丙酮（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.1.2 设备

光照培养箱（KCLP-1000CCFL-CT）：东乐生命科学公司；浮游植物分类荧光仪（PHYTO-PAM WALZ）：德国WALZ有限公司；生物显微镜（E200）：日本Nikon有限公司；冷冻箱（HYCD-205）：青岛海尔有限公司；高压灭菌锅（HVE-50）：北京兴盛恒创有限公司；超净工作台（SW-CJ-1FD）：上海博讯有限公司；分析天平（TOLEDO PL203）：梅特勒-托利公司。

1.2 试验藻种

雨生红球藻来自天津市水产生态及养殖重点实验室。试验培养雨生红球藻采用pH 7的BBM培养基[6]。

1.3 试验设计

1.3.1 对照组培养条件

将培养至对数生长期（5×105个/mL）的雨生红球藻接种到BBM培养基，光照强度设置为55 μmol/m2/s，光暗比为 12 h∶12 h，培养温度为（22±1）℃，每个试验组设置3个平行，每天摇动培养瓶6次，防止细胞附壁或下沉。

1.3.2 光照胁迫培养条件

将培养至对数生长期（5×105个/mL）的雨生红球藻接种到BBM培养基，光照强度设置5个梯度，分别为73、127、182、236、291 μmol/m2/s，其它培养条件同 1.3.1。

1.3.3 NaNO3胁迫培养条件

将培养至对数生长期（5×105个/mL）的雨生红球藻接种到不含有NaNO3的BBM培养基，NaNO3浓度设置 5 个梯度，分别为 0、0.032、0.065、0.13、0.25 g/L，光照强度设置为55 μmol/m2/s，其它培养条件同1.3.1。

1.3.4 NaCl胁迫培养条件

将培养至对数生长期（5×105个/mL）的雨生红球藻接种到不含有NaCl的BBM培养基，NaCl浓度设置5 个梯度，分别为 0、5、7.5、10、12.5 g/L，光照强度设置为 55 μmol/m2/s，其它培养条件同 1.3.1。

1.4 测定指标

试验周期为26 d，每2 d取样测定雨生红球藻细胞的叶绿素荧光参数和虾青素含量。

1.4.1 叶绿素荧光参数测定

利用荧光分析仪（PHYTO-PAM WALZ）测定叶绿素荧光参数，在测定开始前将取得的样品避光暗处理15 min，然后通过读取参数得出最大光能转化效率（Fv/Fm）、实际光能转化效率（PSⅡ）、有效光能转化效率值（Yield）。

1.4.2 虾青素含量测定

参照李嘉仪等[7]以及韦韬等[8-9]的方法测定虾青素含量。取5 mL藻液进行离心，弃去上清液，加入5 mL超纯水清洗，重复两次。然后用5 mL的5%氢氧化钾+30%甲醇水混合溶液破坏叶绿素5 min，弃去上清液后加5 mL超纯水清洗两次。弃去上清液后将收集到的藻泥中加入2 mL丙酮，用细胞破碎仪处理10 min，4℃离心15 min（10 000 r/min），保留上清液，重复以上操作，直至藻团呈白色，色素提取完全为止。

虾青素的含量参照Davies等的采用公式[10]：

虾青素（mg/L）=4.6×A480ast×稀释倍数

1.5 数据处理

使用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析，采用Duncan’s多重比较检验处理组均值的差异显著性，显著性水平设定为0.05。利用EXCEL 2016进行绘图。

田力（1965.06.15-），女，汉族，河南人，博士，河南中医药大学副校长，研究方向：超声医学，e-mail：tianli@hactcm.edu.cn。

2 结果与分析

2.1 光照胁迫对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响

光照胁迫对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响见图1。

图1 光照强度对雨生红球藻荧光参数的影响Fig.1 Effect of light intensity on fluorescence parameters of Haematococcus pluvialis

随胁迫时间延长，光照胁迫处理组微藻Fv/Fm和Yield参数均低于对照组，而对照组的Fv/Fm值一直维持在0.5～0.6之间。随着试验的进行，雨生红球藻Fv/Fm值在第4天后出现明显下降，在第10天后趋于稳定，在第26天各试验组微藻Fv/Fm较初始水平下降了8%～37.9%。在第16、18、24和26天光照胁迫处理组的Fv/Fm显著低于对照组（P＜0.05），光照胁迫处理组Fv/Fm在第10天后显著上升然后逐渐趋于稳定，且不同强度的光照胁迫组之间并差异不显著（P＞0.05）。

2.2 光照胁迫对雨生红球藻积累虾青素的影响

光照胁迫对雨生红球藻积累虾青素的影响见图2。

图2 光照强度对雨生红球藻积累虾青素的影响Fig.2 Effect of light intensity on accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis

由图2可知，在光照胁迫处理下雨生红球藻胞内虾青素含量逐渐升高，各光照胁迫处理组与对照组相比均存在显著差异（P＜0.05）。当光照强度较低时（55 μmol/m2/s～73 μmol/m2/s） 微藻细胞内虾青素含量较低仅为2.5 mg/L～4 mg/L，而高强度光照能够促进雨生红球藻积累虾青素的过程，光照强度127、182、236 μmol/m2/s条件下雨生红球藻胞内虾青素水平明显上升。在试验的第24天光照强度为236 μmol/m2/s的处理组微藻积累虾青素水平达到最高值9.01 mg/L，较对照组提高了55.5%。

2.3 NaNO3胁迫对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响

NaNO3胁迫对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响见图3。

由图3可知，微藻细胞Fv/Fm整体呈先上升后逐渐下降的趋势，各NaNO3胁迫处理组较对照组有显著差异（P＜0.05），无NaNO3处理组Fv/Fm在第10天达到最高值。NaNO3浓度为0.13和0.25 g/L时，雨生红球藻细胞的Fv/Fm和Yield与对照组相比差异并不显著（P＞0.05）。

图3 NaNO3浓度对雨生红球藻荧光参数的影响Fig.3 Effect of NaNO3concentration on fluorescence parameters of Haematococcus pluvialis

2.4 NaNO3胁迫对雨生红球藻积累虾青素含量的影响

NaNO3胁迫对雨生红球藻积累虾青素的影响如图4所示。

由图4可知，NaNO3浓度为0时微藻细胞内积累虾青素的水平显著高于其他试验组（P＜0.05）。氮缺乏是雨生红球藻积累虾青素的主要影响因子之一，但雨生红球藻细胞在绿色游动阶段会积累一定水平的氮源，当细胞处于缺氮环境时会首先消耗自身储存的氮源，等氮素全部消耗完毕后才开始积累虾青素。无NaNO3处理组雨生红球藻在前14 d积累虾青素速率较低，第14天到第22天虾青素合成速率明显加快，并于第22天达到峰值5.60 mg/L，此时微藻胞内虾青素含量较第14天时增高了34%。

2.5 NaCl胁迫对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响

图4 NaNO3浓度对雨生红球藻积累虾青素的影响Fig.4 Effect of NaNO3concentration on accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis

由图5可知，试验期间NaCl胁迫处理的雨生红球藻细胞Fv/Fm和Yield基本维持稳定，NaCl浓度为10和12.5 g/L时雨生红球藻的Fv/Fm和Yield值均低于对照组，而NaCl浓度为5 g/L时微藻细胞Fv/Fm和Yield值均高于对照组。

2.6 NaCl胁迫对雨生红球藻积累虾青素的影响

NaCl胁迫对雨生红球藻积累虾青素的影响如图6所示。

由图6可知，在NaCl胁迫处理下雨生红球藻细胞内虾青素含量呈先逐渐升高后趋于稳定的变化趋势，其中5、7.5、10 g/L浓度组胞内虾青素含量与对照组相比差异显著（P＜0.05），12.5 g/L浓度组与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。从试验第12天后7.5 g/L浓度组微藻细胞积累虾青素水平显著高其它试验组（P＜0.05），在第24天微藻细胞内积累虾青素含量达到峰值，较其它试验组提高了13%～45%。当5、7.5、10 g/L浓度组时雨生红球藻积累虾青素的水平显著高于12.5g/L浓度组（P＜0.05）。

图5 NaCl浓度对雨生红球藻荧光参数的影响Fig.5 Effect of NaCl concentration on fluorescence parameters of Haematococcus pluvialis

图6 NaCl浓度对雨生红球藻积累虾青素的影响Fig.6 Effect of NaCl concentration on accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis

3 讨论

3.1 光照胁迫对雨生红球藻荧光参数和积累虾青素的影响

微藻细胞叶绿素荧光参数主要受PSⅡ光合反应中心结合的醌受体QA的氧化还原状态以及光合电子传递过程中产生的热耗散控制[11]。Hernando等研究表明高强度的光照会抑制微藻细胞PSⅡ光合反应中心的活性，当超出PSII自我修复的能力时，藻细胞会受到明显的伤害[12]。

雨生红球藻的生长、繁殖与虾青素的积累与光照强度关系密切。在适宜的光强范围内，光照强度提高可促进雨生红球藻的光合作用，加强藻细胞生理代谢和物质合成，但当光照强度超过雨生红球藻的承受能力，微藻光合作用将受到抑制[13]。本试验发现，在第24天，光照强度为236 μmol/m2/s的处理组藻细胞内虾青素水平最高达9.01 mg/L，且显著高于其它试验组（P＜0.05），但是当光照强度达到291 μmol/m2/s时微藻细胞内虾青素的积累量下降，仅为7.91 mg/L。有发现在光照强度为 50 μmol/m2/s～240 μmol/m2/s时，雨生红球藻细胞中的虾青素含量随着光照强度增强而上升，与本研究的结论一致。才金玲等[14]认为高光强使雨生红球藻光合作用和含氮化合物的生物合成减弱，微藻细胞出现胁迫应激，细胞内与虾青素合成相关的基因被激活，微藻开始合成并积累虾青素，而虾青素具有保护细胞免受胁迫伤害的作用[15]。

3.2 NaNO3胁迫对雨生红球藻荧光参数和积累虾青素的影响

氮是微藻不可或缺元素，氮缺乏会影响微藻的生长繁殖，干扰叶绿素、蛋白质及核酸等大分子的生物合成，并削弱光合反应速率和水平[16-17]。Marin等[18]发现氮胁迫使杜氏盐藻的Fv/Fm水平下降，与本研究的结果一致。在氮胁迫初期雨生红球藻叶绿素荧光参数均有不同程度变化，说明微藻受到缺氮胁迫时光化学活性会瞬时升高，胁迫时间延长藻细胞因为氮素缺乏其光合作用受到抑制，叶绿素荧光参数逐渐恢复稳定。

低氮胁迫可诱导雨生红球藻细胞启动合成虾青素的保护机制。Borowitzka等[19]、邹宁等[20]研究均发现当氮素在低浓度下均可快速胁迫雨生红球藻积累虾青素。本试验发现随着培养环境中氮素含量的减少，雨生红球藻积累虾青素的水平明显提高，缺氮可促进微藻内虾青素的合成，当培养基氮源浓度为0时，经过22 d培养雨生红球藻细胞中的虾青素含量达到峰值。庄惠如等[21]、杨瑾等[22]研究发现当雨生红球藻培养基中氮元素的浓度减少一半时有利于虾青素积累，且微藻细胞内的虾青素水平与氮浓度呈反比，这与本研究的结论一致。

3.3 NaCl胁迫对雨生红球藻荧光参数和积累虾青素的影响

细胞叶绿素荧光参数的变化可在一定程度反映环境因子对微藻的影响。有研究表明在适宜的环境条件下Fv/Fm趋于稳定，当微藻细胞受到高盐胁迫处理后该值明显下降[23]，本研究中高盐胁迫下NaCl浓度为10、12.5 g/L，雨生红球藻细胞的Fv/Fm均低于对照组的结果正印证了这一点。高盐胁迫抑制藻类光合作用的影响机制主要表现在PSⅡ受到氧化损伤[24]以及转换态转换而引起的损伤[25]。

高盐胁迫是诱导雨生红球藻合成虾青素常用方法，探究适宜盐浓度范围对雨生红球藻高效合成虾青素有重要的实践意义[26]。虽然高盐胁迫对雨生红球藻细胞的生长存在抑制，但能促进雨生红球藻绿色细胞快速转变为红色孢子状并累积虾青素。本研究发现高盐胁迫处理促进雨生红球藻细胞积累虾青素，在试验第22天试验组微藻细胞积累虾青素水平达到峰值并趋于稳定，第24天高盐胁迫使雨生红球藻细胞全部由绿色游动阶段转变为红色不动孢子，与Huang的研究结果一致。Huang等[27]的研究发现浓度低于10 g/L的NaCl能诱导雨生红球藻快速积累虾青素。Boussiba等[28]的研究表明当培养环境中的NaCl浓度增加3倍时，雨生红球藻合成虾青素的速率明显上升。然而高盐胁迫促进雨生红球藻合成虾青素的具体调控机制制目前尚不清楚，有待进一步探究。

4 结论

1）光照胁迫处理组微藻Fv/Fm和Yield参数均低于对照组。在光照胁迫处理下雨生红球藻胞内虾青素含量逐渐升高，各光照胁迫处理组与对照组相比均存在显著差异（P＜0.05）。高强度光照能够促进雨生红球藻积累虾青素的过程，在试验的第24天光强为236 μmol/m2/s的处理组微藻积累虾青素水平达到最高值9.01 mg/L，较对照组提高了55.5%。

2）NaNO3胁迫处理使雨生红球藻细胞Fv/Fm整体呈先上升后逐渐下降的趋势，各NaNO3胁迫处理组较对照组有显著差异（P＜0.05）。NaNO3浓度为0 g/L时微藻细胞内积累虾青素的水平显著高于其他试验组（P＜0.05）。无NaNO3处理组雨生红球藻在前14 d积累虾青素速率较低，第14天到第22天虾青素合成速率明显加快，并于第22天达到峰值5.60 mg/L。

3）NaCl胁迫处理下的雨生红球藻细胞Fv/Fm和Yield基本维持稳定。在NaCl胁迫处理下雨生红球藻细胞内虾青素含量呈先逐渐升高后趋于稳定的变化趋势，其中5、7.5、10 g/L浓度组胞内虾青素含量与对照组相比差异显著（P＜0.05），12.5 g/L浓度组与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。从试验第12天后7.5 g/L浓度组微藻细胞积累虾青素水平显著高其它试验组（P＜0.05），在第24天微藻细胞内积累虾青素含量达到峰值。