吕佳玮，刘亚琼，路瑶，商飞飞，王颉，郭书贤，马艳莉，，*，牟建楼，*

（1.贺州学院广西果蔬保鲜和深加工研究人才小高地，广西贺州542899；2.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000；3.南阳理工学院河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳473004）

柿子（Diospyros kaki Thunb.）是一种重要的水果作物，我国是世界上柿子产量最多的国家，也是拥有柿属植物遗传资源最丰富的国家，根据国家统计局数据显示，2016年我国柿子果实产量为396.9万吨。柿子中含有丰富的酚类，特别是黄酮类和单宁类物质，具有广泛的生物活性，包括清除自由基[1]、预防心血管疾病和抗癌等[2]。柿子糖含量高，在水果中甜味居于首位，有“最甜的金果子”的美称，深受人们喜爱，它所含有的游离酸和一些糖类物质，如葡萄糖、果糖和甘露醇等，易于被人体消化和吸收。目前，我国对柿子的利用率较低，柿子加工产品主要以脱涩脆柿子、柿饼为主，还有一些柿醋、柿汁、柿叶茶等。

果酒作为世界畅销型产品，占据世界饮用酒的15%～20%[3]。近年来，越来越多的研究者开始关注果酒研发，以苹果、梨子、樱桃等水果为主要原料酿造的果酒在市场上取得了很大的成功，具有保健功能的植物资源，如山楂、柿子、猕猴桃、芒果、香蕉、橙子、杏等，也越来越多地应用到果酒生产中[4]。以柿子为原料酿造的酒，具有酒精度低、营养价值高、保健功能强的特点[5]。目前柿子酒的酿造工艺需要改善[6]，用不同处理方式处理发酵的柿子酒的研究比较少，特别是原料预处理对柿子酒品质的影响缺乏研究。

本研究以柿子为主要原料，使用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）和气质联用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）技术对不同原料预处理酿造的柿子酒中挥发性风味物质相对含量、种类差异性进行分析，确定各香气成分对柿子酒香型特征风格的影响，以期为柿子酒的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

磨盘柿：2018年采摘于河北省保定市，采后放置于4℃冷库储藏备用；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶 LYSIS MPC（2.25×104U/g）：烟台帝伯仕自酿机公司；氯化钠（分析纯）：天津天利化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

5977A气相色谱与质谱联用设备：美国Agilent有限公司；HH-4电热水浴锅：上海比朗仪器有限公司；ID5002C电子天平：天津天马横基仪器有限公司；SPX型生化培养箱：上海东器实业有限公司；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱：广东精华智能装备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 柿子酒酿造工艺流程

柿子→挑选→去柄→打浆→不同处理→加入酵母→发酵检测→澄清→过滤→成品

1.3.2 酵母活化

将活性干酵母和2%的葡萄糖水按照1∶10（g/mL）的比例混合于小烧杯中，小心静置在36℃～38℃的恒温水浴锅中，每隔10 min轻轻摇晃一次，有丰富浓密的小气泡产生，即代表活化成功，时间在20 min～30 min为宜[7]。

1.3.3 果胶酶对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响

为了研究果胶酶对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响，称取4 000 g成熟度高的柿子，进行挑选、去柄、打浆，将柿子浆分为2组，一组中加入0.1%的果胶酶，在45℃水浴中水浴3 h，另一组不加果胶酶。将酿酒酵母进行活化，酵母活化同1.3.2，将活化好的酵母加入到处理好的柿子浆中，将两组柿子浆分别分装到15个发酵瓶中，每3个作为平行试验，在24℃恒温培养箱中发酵8 d，每隔1 d进行取样，将取出的样品贮藏在-4℃冰箱中备用，测量柿子酒发酵过程中挥发性风味成分。

1.3.4 去皮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响

为了研究去皮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响，称取4 000 g成熟度高的柿子，进行挑选、去柄，将挑选好的柿子分为2组，一组做去皮处理，另一组不做去皮处理。将两个处理进行打浆，加入0.1%的果胶酶，在45℃水浴中处理3 h[8]。将酿酒酵母进行活化，酵母活化方法同1.3.2，将活化好的酵母，加入到处理好的柿子浆中，搅拌均匀，将两个处理柿子浆分别分装到15个发酵瓶中，每3个作为平行试验，在24℃恒温培养箱中发酵8 d[9]，每隔1 d进行取样，将样品贮藏在-4℃冰箱中备用，测量柿子酒发酵过程中挥发性风味成分。

1.3.5 蒸煮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响

为了研究蒸煮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响，称取4 000 g成熟度的柿子，进行挑选、去柄、打浆，将柿子浆分为2组，一组将柿子浆煮15 min，另一组不做蒸煮处理。待柿子浆冷却，两个处理均加入0.1%的果胶酶，在45℃水浴中处理3 h。将酿酒酵母进行活化，酵母活化方法同1.3.2，将活化好的酵母，加入到处理好的柿子浆中，搅拌均匀，将两个处理柿子浆分别分装到15个发酵瓶中，每3个作为平行试验，在24℃恒温培养箱中发酵8 d，每隔1 d进行取样，将样品贮藏在-4℃冰箱中备用，测量柿子酒发酵过程中挥发性风味成分。

1.3.6 挥发性风味物质测定方法

1.3.6.1 柿子酒挥发性风味物质的萃取

参照齐晓茹等[10]的方法并稍作改进，取样品7.5 mL于钳口瓶，加入1.0 gNaCl。在40℃恒温水浴锅中平衡15 min，之后插入纤维头吸附40 min，取出后立即在气相色谱（gas chromatography，GC）进样口解析 6 min，开始运行方法。

1.3.6.2 气相色谱条件

进样口温度240℃，载气氦气，流速1.45 mL/min，不分流。柱箱升温程序：先以50℃的升温程序，保持2 min，再以3℃/min的升温速度升至80℃，随之以5℃/min的升温速度升至230℃，保持6 min。质谱条件：电离方式EI，离子源温度240℃，电子电压70 eV，检测器电压350 V，辅助加热器温度250℃，四级杆温度150℃，采用全扫描（Scan）模式采集信号，扫描范围33 m/z～550 m/z。

1.3.7 数据处理方法

试验结果统计分析方法使用SPSS17.0软件进行统计分析，差异显著性水平为0.05，使用Origin9.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同原料预处理柿子酒中主要挥发性风味物质

使用HS-SPME和GC-MS技术检测不同原料预处理柿子酒中挥发性香气物质[11]，其挥发性风味物质总离子流图如图1所示。

原料去皮处理、带皮处理、蒸煮处理、不蒸煮处理、添加果胶酶、不加果胶酶分别检测出挥发性风味物质43、47、42、46、44、38 种，主要挥发性香气物质如表 1所示。

柿子酒中的主要挥发性风味物质主要有酯类、醇类、酸类、醛酮类和其他类。主要酯类物质包括正己酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、癸酸甲酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯、月桂酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯，原料去皮和蒸煮处理中未检测到庚酸乙酯，不加果胶酶未检测到丁酸乙酯、庚酸乙酯。主要的醇类物质包括异戊醇、异丁醇、3-甲硫基丙醇、（R）-（+）-β-香茅醇、2，3-丁二醇、4-萜烯醇、苯乙醇、甘油，原料去皮处理和蒸煮处理未检测到4-萜烯醇，而不添加果胶酶处理中仅检测到（R）-（+）-β-香茅醇、2，3-丁二醇、苯乙醇三种醇类物质。主要的酸类物质包括辛酸、癸酸、月桂酸、己酸、棕榈油酸、乙酸，棕榈油酸在去皮处理和不加果胶酶处理中未检测到，主要醛酮类物质包括苯甲醛、苯乙醛、5-羟甲基糠醛、5-甲基呋喃醛、2-甲基四氢噻吩-3-酮、3-羟基-2-丁酮，其他类物质包括苯乙烯、环十二烷、环辛四烯、正十三烷、右旋萜二烯。不同处理发酵的柿子酒挥发性风味物质有所差异，说明不同原料预处理对柿子酒中挥发性风味物质有影响。

图1 柿子酒挥发性风味物质GC-MS总离子流图Fig.1 Persimmon wine GC-MS total ions chromatogram of volatile flavor substances

表1 不同原料预处理对柿子酒中主要挥发性风味物质的影响Table 1 Effects of different material pretreatments on main volatile flavor substances in persimmon liquor

续表1 不同原料预处理对柿子酒中主要挥发性风味物质的影响Continue table 1 Effects of different material pretreatments on main volatile flavor substances in persimmon liquor

2.2 添加果胶酶对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响

添加果胶酶对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响如图2所示。

加果胶酶处理的柿子酒中酯类物质含量远远高于不加果胶酶处理的，说明加果胶酶可以增加柿子酒的酯类物质。加果胶酶处理和不加果胶酶处理的柿子酒中共检测出酯类物质14和11种，含量分别为其44.48%、25.82%，其中，月桂酸甲酯（酒香、花香）、十一酸乙酯（葡萄酒香、酯香、果香、椰香）、丁酸乙酯（苹果香）、丁二酸二乙酯（有愉快气味）、己酸异戊酯（巧克力）仅在加果胶酶处理组检出，很好修饰了柿子酒中的香气成分[13]。

图2 添加果胶酶对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响Fig.2 Effect of pectinase addition on volatile flavor compounds in fermentation process of persimmon wine

醇类是酒精发酵主要产物之一，主要由糖代谢、氨基酸脱羧和脱氢产生，它能赋予酒特有的香气[14]结果表明，加果胶酶处理的柿子酒中醇类物质含量比不加果胶酶处理的含量高，前者共检出7种醇类物质，含量为31.56%，后者检出5种醇类物质，含量为25.84%，相对含量较高的醇类有异戊醇（有苹果白兰地香气）、正己醇（叶子风味、青草味、吐司味）、苯乙醇（玫瑰花香、蔷薇花香、香粉味），果胶酶的添加能有效地减少异丁醇、糠醇、庚醇的生成，并能促进果汁中香气物质的释放。

柿子酒中的酸类物质大部分是酒精发酵和苹乳发酵的副产物，有研究发现，酸类物质含量在合适范围内时，对酒的感官品质有积极贡献，为酒带来新鲜感并平衡果香[15]。如图2c所示，不加果胶酶处理发酵的柿子酒中酸类物质含量远远高于加果胶酶处理，主要的酸类物质有辛酸（奶酪味、腐败味、涩味）、癸酸（不愉快的脂肪味）、己酸（类似甜味）、乙酸（酸味和辛辣刺激味），果胶酶的添加能明显减少酒中辛酸和癸酸的释放，对酒体风味起一定保护作用。

其他类物质包括醛、酮、以及呋喃等物质，这些物质大多对酒体的香气品质有消极影响[16]，加果胶酶处理的柿子酒中共检出9种，相对含量为5.73%，不加果胶酶处理的柿子酒中共检出10种，相对含量为10.57%，果胶酶的添加能减少这类物质的产生，对酒的香气有一定保护作用。

综上所述，果胶酶的加入增加了酒中酯类和醇类物质的含量和种类，丰富了柿子酒的香气，减少了辛酸、癸酸的释放和一些对酒品质有消极影响的醛、酮、以及呋喃等物质，所以，添加果胶酶为较合适的原料预处理方法。

2.3 去皮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响

去皮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响如图3所示。

图3 去皮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响Fig.3 Effect of peeling on volatile flavor substances during fermentation of persimmon wine

在发酵过程中，带皮处理发酵的柿子酒中的酯类物质含量比去皮处理发酵的柿子酒中酯类物质含量高（图3a），十三烷酸乙酯、异戊酸己酯、甲酸苯酯、10-甲基十一烷酸甲酯、十五酸乙酯等仅在带皮处理组检测出，去皮处理组未检出，在带皮处理发酵和去皮处理的柿子酒中分别检测出17种和15种酯类物质，分别占总香气成分的43.74%、34.35%，其中含量较多的的酯类物质有辛酸乙酯（果香、菠萝、梨、花香）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香、蜂蜜香）、癸酸乙酯（白兰地酒香味）、月桂酸乙酯（花香、果香、肥皂味）等，去皮处理降低了正己酸乙酯、乙酸异戊酯等大部分酯类物质的含量，减少了柿子酒中青苹果、茴香味、类似香蕉香味等特殊香气，而去皮处理中棕榈酸乙酯的含量较高，增添了蜡香、果酱、奶油香味。

由图3b所示，在发酵前2 d带皮处理发酵的柿子酒中醇类物质比去皮处理组的高，在发酵后4 d，去皮处理发酵的柿子酒中醇类物质含量较高，香茅醇、苄醇、4-萜品醇仅在去皮处理组检出，而带皮组未检出，3-甲基-1-戊醇仅在带皮处理组检出，在带皮处理发酵和去皮处理的柿子酒中分别检测出9种和6种醇类物质，分别占总香气成分的42.91%、40.86%，其中含量较多的醇类物质有异戊醇（有苹果白兰地香气）、苯乙醇（玫瑰花香、蔷薇花香、香粉味）、3-甲硫基丙醇（低浓度有强烈芬芳的肉或肉汤香气）等，去皮处理降低了醇类物质的含量，减少了香气的浓度，但是，去皮处理增加了柿子酒中3-甲硫基丙醇的含量。

在发酵过程中，两种处理发酵的柿子酒中酸类物质含量呈现先上升后下降的趋势，酒中的挥发酸主要来源于酒精发酵，其含量取决于发酵条件、发酵汁的营养水平和酵母[17]。在带皮处理发酵和去皮处理的柿子酒中分别检测出4种和7种酸类物质，分别占总香气成分的11.02%、22.85%，其中乙酸（酸味和辛辣刺激味）、辛酸（奶酪味、腐败味、涩味）、癸酸（不愉快的脂肪味）、己酸（类似甜味）、苯甲酸、乙酸（酸味和辛辣刺激味）等含量较高，而去皮处理增加的酸类物质的含量。

去皮处理对柿子酒发酵过程中醛酮类以及其他类物质的影响如图3d和3e所示。两个处理中醛酮类物质和其他物质的含量随发酵进行而下降，癸醛、5-甲基呋喃醛、2，4-二叔丁基苯酚（石炭酸味）、苯酚、右旋萜二烯（似鲜花的清淡香味）等物质仅在去皮处理中检出。

综上所述，带皮处理发酵的柿子酒中醇类物质和酯类物质均含量高于去皮处理的，而酸类物质和醛酮类物质均低于去皮处理，带皮处理的柿子酒中具有浓郁的果香，苦涩味等不愉快风味明显减少，所以带皮处理为较合适的柿子酒酿造的原料预处理方法。

2.4 蒸煮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响

蒸煮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响如图4所示。

图4 蒸煮对柿子酒发酵过程中挥发性风味物质的影响Fig.4 Effect of cooking on volatile flavor compounds in fermentation process of persimmon wine

酯类物质含量随着发酵时间的增长呈现先上升后下降的趋势（图4a所示），发酵前期酯类物质含量升高是酵母菌生长代谢产生，主要是发生脂肪氧化、氨基酸代谢、酸和醇的缩合反应[18]，而后期其含量下降可能是由于作为了某些反应的反应物，生成了其他物质。蒸煮组无论是在发酵过程中还是发酵最后都比不蒸煮组的含量高，这可能是因为蒸煮过程中，醇和酸发生了有效的碰撞，从而使酯类物质含量上升，癸酸甲酯、庚酸乙酯、十四酸乙酯、月桂酸甲酯、辛酸3-甲基丁酯、苯甲酸乙酯、乙酸苏合香酯、3-羟基丁酸乙酯等是不蒸煮组特有的酯类，而蒸煮组中没有检测到，这些酯类具有丰富水果香气和花香，9-癸烯酸乙酯具有脂肪、轻微果香，仅在蒸煮组检出。1-戊醇、（R）-（+）-β-香茅醇分别在不蒸煮组第0天和第8天检测出。蒸煮处理发酵成品酒中检测出12种，不蒸煮处理发酵成品酒中检测出13种，主要的酯类物质有正己酸乙酯（青苹果、茴香味）、辛酸乙酯（果香、菠萝、梨、花香）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香、蜂蜜香）、丁二酸二乙酯（有愉快气味），蒸煮处理增加了正己酸乙酯、辛酸乙酯的含量，而降低了乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯的含量。

如图4b所示，两组处理醇类物质含量随发酵的进行呈先上升后下降，不蒸煮处理柿子酒的醇类物质含量比蒸煮处理醇类物质含量高，十二醇仅在蒸煮组第0天检出。发酵终点蒸煮组柿子酒中挥发性香气检出物中醇类物质的种类分为6种，相对含量为37.93%。不蒸煮组柿子酒中挥发性香气检出物中醇类的种类分别8种，相对含量为46.78%。在醇类物质中，两种处理中的苯乙醇（玫瑰花香、蔷薇花香、香粉味）和异戊醇（温和的特殊气味）含量较高，而蒸煮处理降低了醇类物质的含量。

如图4c所示，在发酵的前4 d，不蒸煮处理组柿子酒中酸类物质含量比蒸煮处理组柿子酒中酸类物质含量高，这可能是因为蒸煮过程加快了酸类物质与醇类物质反应，从而使酸类物质含量较低，而到发酵后4 d时，蒸煮处理组柿子酒中酸类物质含量比不蒸煮处理组柿子酒中酸类物质含量高，在酸类物质中，乙酸、辛酸（奶酪味、腐败味、涩味）、癸酸（不愉快的脂肪味）、月桂酸（微有月桂油香气）含量较高。蒸煮处理发酵的柿子酒中共检测出5种酸类物质，而不蒸煮处理发酵的柿子酒中共检测出7种酸类物质。

蒸煮处理对柿子酒发酵过程中醛酮类以及其他类物质的影响如图4d和4e所示。3-羟基-2-丁酮、壬醛、右旋萜二烯、苯并环丁烯仅在蒸煮处理发酵的柿子酒中检测出，其中右旋萜二烯有似鲜花的清淡香味，是在酿造过程中由于糖苷酶酶解生成的香气化合物[19]。

综上所述，蒸煮处理增加了正己酸乙酯（青苹果、茴香味）、辛酸乙酯（果香、菠萝、梨、花香）的含量，果香味增加，减少了乙酸、辛酸（奶酪味、腐败味、涩味）、癸酸（不愉快的脂肪味）等的含量，不愉快风味较少，所以蒸煮处理为较合适的原料预处理方法。

3 结论

使用HS-SPME和GC-MS联用技术对不同原料预处理酿造的柿子酒挥发性风味物质进行分析，原料去皮处理、带皮处理、蒸煮处理、不蒸煮处理、添加果胶酶、不加果胶酶分别检测出挥发性风味物质43、47、42、46、44、38 种，主要挥发性风味物质以酯类、醇类、酸类为主，还有少量醛酮类、萜烯类；去皮处理减少了酯类物质的含量，癸酸、辛酸等脂肪酸的含量升高，对柿子酒香气成分有负面影响；蒸煮处理提高了酯类和萜烯类物质的含量；果胶酶的添加能减少挥发酸的生成，同时能起到很好的澄清作用，带皮、蒸煮、加果胶酶处理能很好的改善柿子酒的香气组成，所以确定带皮、蒸煮、添加果胶酶为柿子酒较优的原料处理方法。