鲍芸，肖艳群，张芃胤，权静，王雪亮，王华梁(上海市临床检验中心，上海 200126)

苯丙酮尿症是苯丙氨酸代谢途径中苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺陷所导致的较为常见的一种常染色体隐性遗传性疾病。其致病变异类型多样，国际上已报道的PAH变异类型有1 000余种(http://www.biopku.org/PAH)，不同国家和种族之间发病率和变异分布存在差异。目前中国已报道的变异类型约有190余种，较常见的变异有c.728G>A(R243Q)、c.442-1G>A(IVS4-1G>A)、c.611A>G(p.Ex6-96 A>G)、c.842+2T>A(IVS7+2 T>A)等位点，且大多为杂合变异类型[1-2]。随着疾病诊断、新生儿筛查与预防技术的发展，苯丙酮尿症已经成为可治疗、可预防的疾病，属于少数可治疗的罕见病之一。对PAH基因检测可以从分子水平上明确致病原因，并为早期临床干预、遗传咨询以及患者父母再生育等提供遗传依据。

目前，除了传统的Sanger测序法外，核酸质谱分析法、反向斑点杂交法、数字PCR法等多种分子检测方法被用于苯丙酮尿症的遗传基因检测[3-5]。但因PAH基因结构复杂，致病变异类型多样，实验室检测多采用实验室自建检测方法(laboratory developed tests，LDTs)。这些检测方法的仪器设备相对复杂，检测试剂通常需要根据不同检测方法需求配制，对操作人员素质和技术能力要求高，同时对结果解释的临床水平要求高，给质量控制和管理带来一定挑战。本研究针对PAH遗传基因检测开展室间质量评价(简称室间质评)计划，通过实验室上报结果总结，分析临床实验室在PAH基因检测中存在的问题，希望能加强临床实验室该项目检测的质量控制意识，提高检测质量。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1室间质评样本的制备 分离携带PAH基因变异[所含变异位点包括c.728G>A(p.R243Q)、c.442-1G>A(IVS4-1G>A)、c.611A>G(p.Ex6-96A>G)和c.842+2T>A(IVS7+2T>A)]的外周血样本单个核细胞，进行原代细胞培养并纯化基因组DNA，加入健康人全血标本中，制备成的带有杂合突变类型(突变比例50%)全血滴在滤纸片上制成滤纸干血斑，直径1.6 cm。

1.1.2室间质评样本的评价 采用Sanger测序法对样本进行检测确定靶值，同时采用高通量测序法对样本进一步验证。Sanger测序法使用血液基因组DNA纯化试剂盒(广州达瑞生物公司)分离得到基因组DNA，以TaKaRa Ex Taq®DNA Polymerase高温聚合酶(北京宝日医生物公司)进行PCR反应后利用3730xl DNA测序仪(美国ABI公司)进行变异检测。高通量测序法使用目标区域捕获通用试剂盒和MGISEQ-2000RS 高通量测序试剂盒(武汉华大智造科技公司)进行PAH基因区域捕获建库，使用MGISEQ-2000基因测序仪(武汉华大智造科技公司)测序。

1.2方法

1.2.1室间质评方案设计 苯丙酮尿症基因检测项目室间质评计划为1年2次，室间质评样本盘含有5个样本。将样本统一编码后冷链快递至各参评实验室。考虑到不同临床实验室实际检测情况，可选择本实验室开展的检测位点进行结果回报。要求参评实验室运用日常检测系统(仪器、试剂、方法)进行样本检测，上报结果时首先判断样本中是否含有致病性变异，其次依据目前国际上公认的人类基因组变异协会(human genome variation society，HGVS)的标准命名规则[6]上报具体变异位点。在规定时间内(自样本接收后3周之内)将检测结果上报至中心数据库，超过规定时间系统将不再接收数据。

1.2.2结果评价标准与分析 依据回报结果计算各参评实验室的得分情况。具体评价标准：(1)致病变异型(阳性)样本报告为“阳性”为可接受结果；任何一致病变异型(阳性)样本结果报告为“阴性”，该样本计0分。(2)无致病变异(阴性)样本报告为“阴性”为可接受结果；任何无致病变异(阴性)样本结果报告为“阳性”，为不可接受结果，该样本计0分。(3)致病变异型(阳性)样本中所含所有致病变异位点报告形式和内容均正确，则该样本结果不扣分，如出现检测错误则对该样本成绩扣分[该样本扣分数=(错误位点个数/所有致病变异位点个数)×20]，如出现变异位点回报形式错误则按2分/样本在样本成绩中进行扣分。(4)单个位点检测成绩=测定可接受结果数/所有上报结果数)×100。(5)本项目总成绩=各样本得分总和，得分≥80分为合格，成绩<80分为不合格。同时对错误的检测结果进行统计，计算不同变异位点及不同检测方法的符合率。

2 结果

2.1室间质评样本验证结果 室间质评样本采用Sanger测序法进行基因型检测确定靶值并使用高通量测序法对结果进一步验证。2019年苯丙酮尿症基因检测室间质评样本盘构成及预期结果见表1。

2.2苯丙酮尿症基因检测实验室总体回报情况 报名参加2019年2次苯丙酮尿症基因检测室间质评计划的实验室均为4家，在规定时间内收到的有效回报结果分别为3份和2份。2019年室间质评样本检测符合率见表1。

在2次室间质评活动中，参评实验室主要采用Sanger测序技术和实验室自配试剂(LDT)进行检测。室间质评计划样本盘设计包含4个阳性和1个阴性样本，阳性样本中涉及4个PAH基因变异位点，包括中国人群常见致病变异位点c.728G>A (p.R243Q)、c.442-1G>A(IVS4-1G>A)、c.611A>G(p.Ex6-96A>G)和c.842+2T>A(IVS7+2T>A)。4种变异涉及错义变异和剪接变异2种变异类型，其中错义变异符合率100%，剪接变异符合率55%。同时样本盘4个阳性样本中，设计2个为相同样本以考察实验室重复检测能力。各变异类型及检测总体符合率见表2。

表1 2019年苯丙酮尿症基因检测室间质评样本盘构成及检测符合率

表2 阳性样本中致病变异类型及检测符合率

2.3各实验室检测能力评价 作为遗传病检测，本项室间质评不仅考察实验室正确检测样本中变异的能力，判断变异位点的致病性的生物信息分析能力，还考察实验室对变异位点以目前国际公认的HGVS基因变异命名规则进行规范报告的能力。因此结果评分标准涉及以上3项内容，3项结果完全正确，才能得满分。2019年2次室间质评中，结果回报完全正确的实验室分别为0和2家。第1次室间质评中，成绩合格的实验室为1家，见表3。

2次室间质评中阴性样本(野生型样本)的检测符合率为100%(10/10)，阳性样本(变异型样本)的检测符合率为70%(14/20)。结果汇总中出现的6例检测错误均发生在第1次室间质评中，错误的类型集中表现为假阴性。第1次室间质评中，3家实验室回报的检测结果均未完全遵从HGVS标准命名规则，因此尽管实验室检测结果正确，也未得满分。在第2次室间质评中实验室结果报告规范程度有所提升，参评实验室均按HGVS命名规则进行变异描述。

表3 室间质评成绩汇总[n(%)]

3 讨论

苯丙酮尿症基因检测能够从分子水平上明确患者致病原因，为早期临床干预、指导低苯丙氨酸特殊饮食及患者父母再生育遗传咨询等提供依据。因此结果的准确性尤为重要。室间质量评价作为质量保证的重要手段，能够帮助实验室发现问题，提高检测质量。

苯丙酮尿症作为罕见病的一种，临床上基本采用LDTs方法进行检测，开展检测的实验室不多，因此参加本项室间质评实验室较少。由于质评数据较少，可能无法全面分析实验室存在的问题，但通过调查也反映出当前实验室使用LDTs检测及结果报告中存在的一些常见问题。2次室间质评共出现6例错误结果，集中出现在第1次室间质评中，且错误类型均为假阴性结果。室间质评样本盘设计包含4个阳性和1个阴性样本，其中4个阳性样本中2个样本为重复样本，以考察实验室检测的批内精密度，但结果显示仅有1家实验室回报2个重复样本的正确结果，表明部分实验室检测结果的重复性有待提高。调查发现1家实验室Sanger测序外送第三方公司，而测序实验过程质量无法保证，测序数据图谱中出现较多杂峰，影响变异位点识别与判断，这是导致假阴性结果的原因之一。

阳性样本中致病变异类型包含错义变异和剪接变异2种类型，2类变异的检出符合率分别为100%(10/10)和55%(11/20)。第1次质评活动中1家实验室仅检出错义变异，对样本中的剪接变异全部漏检。错义变异类型只需要根据外显子区域DNA序列的改变，分析与之对应的蛋白质水平上氨基酸的改变，而剪接变异为在RNA水平上由于剪接的供体、接纳体部位或其旁侧保守序列的变异，改变RNA前体的剪接方式，从而导致最终成熟RNA序列发生改变(含有内含子或缺失外显子)的一类变异。通过与实验室技术人员沟通发现，大部分实验室的测序结果中对所有突变位点均能检测出，但后续生物信息分析过程中部分技术人员对剪接位点变异的识别和致病性判断能力不足，导致假阴性结果。质评结果反映出部分实验室生物信息分析能力不足，这也是当前国内实验室存在的普遍问题之一[7]。

本项室间质评计划还将基因变异规范命名纳入评价中。统一规范的基因变异命名能精准地描述遗传物质上所发生的特定改变，减少因基因描述所发生的混淆现象，使检测报告更加规范，为后续临床解读、诊疗提供便利。HGVS命名规则是目前国际上公认的规则，被国际人类基因组组织(The Human Genome Organization, HUGO)、美国医学遗传学与基因组学学会(The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)等组织所采纳和推荐[8-9]。从回报结果看，实验室能够对变异在DNA水平上进行描述，描述方式基本正确，但存在未注明基因参考序列和缺乏对变异位点等位基因杂合性描述的问题。通过室间质评活动能够帮助实验室认识相关问题，在第2次室间质评中回报正确的结果。

苯丙酮尿症基因检测结果对后续临床医疗决策具有决定性意义，精确的早期诊断能够让患者及时控制苯丙酸摄入量，减少苯丙氨酸升高对大脑的毒性作用，预防和改善患者智能发育障碍，因此临床对遗传病相关基因检测项目检测结果准确性的要求很高。希望通过室间质评项目的开展，帮助实验室进一步加强包括LDT项目在内的风险管理意识。针对质评中发现的问题，建议实验室参照相关指南和专家共识从准确度、精确度、参考范围、可报告范围、分析灵敏度、分析特异性、临床验证等方面对检测项目性能进行评估[10-11]，检测过程中做好相关质控工作，提高检测质量，更好地服务于患者。