王赛赛，潘丽萍，姜广路，李自慧，贾红彦，孙琦，张宗德，刘洋(首都医科大学附属北京胸科医院&北京市结核病胸部肿瘤研究所.流行病学研究室，.耐药结核病研究北京市重点实验室，.国家结核病临床实验室，北京101149)

广泛存在于自然界中的非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)主要侵犯宿主肺、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等并造成全身播散[1]。鸟-胞内分枝杆菌复合群(Mycobacteriumavium-intracellularecomplex，MAC)是我国临床标本中分离率最高的NTM[2]。其中，鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium，MA)占艾滋病患者合并MAC感染的98%[3]，合并NTM感染的95%以上[4]，在医学界引起广泛重视。

由MAC感染引起的鸟分枝杆菌病，早期症状不明显，多是发展到中后期通过X光片和CT检查才被发现[5]。随着分子生物学技术的发展，PCR技术不断改进和完善，特别是实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)的逐步应用为MA在基因诊断水平的研究提供了重要技术支撑。与普通PCR相比，基于SYBR Green Ⅰ荧光染料的qPCR熔解曲线法可缩短检测时间、降低交叉污染的风险[6]。因此，本研究基于SYBR Green Ⅰ荧光染料建立鉴定MA的qPCR方法，并以PCR-DNA直接测序技术为“金标准”，评估其对临床分离株的鉴定效果，为今后临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1菌株种类及来源 21种分枝杆菌标准菌株包括鸟分枝杆菌(ATCC 25291)、胞内分枝杆菌(ATCC 13950)、脓肿分枝杆菌(ATCC 19977)、龟分枝杆菌(ATCC 14472)、堪萨斯分枝杆菌(ATCC 12478)、戈登分枝杆菌(ATCC 14470)、偶发分枝杆菌(ATCC 6481)、草分枝杆菌(ATCC 11758)、金色分枝杆菌(ATCC 23366)、瘰疬分枝杆菌(ATCC 19981)、浅黄分枝杆菌(ATCC 43909)、耻垢分枝杆菌(ATCC 19420)、结核分枝杆菌(ATCC 27294)、马尔摩分枝杆菌(ATCC 29571)、猿猴分枝杆菌(ATCC 25275)、苏加分枝杆菌(ATCC 35799)、猪分枝杆菌(ATCC 33776)、土地分枝杆菌(ATCC 15755)、微黄分枝杆菌(ATCC 14474)、迪氏分枝杆菌(ATCC 19340)、施氏分枝杆菌(ATCC 27962)。5种常见致病菌包括金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、藤黄微球菌(CMCC 28001)、腐生葡萄球菌(ATCCBAA750)。21种分枝杆菌标准菌株、藤黄微球菌均来自首都医科大学附属北京胸科医院国家结核病临床实验室；金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、腐生葡萄球菌均来自首都医科大学附属北京胸科医院检验科。200株分枝杆菌临床分离株分离自2019年1月至10月首都医科大学附属北京胸科医院疑似分枝杆菌感染患者的痰标本，所有样本经40 g/L氢氧化钠处理后，接种于酸性罗氏培养基，分离株通过测定16S rDNA、rpoB、hsp65和ITS-1中2个序列进行菌种鉴定，并采用Middlebrook 7H9培养基(含10%甘油)保存于-70 ℃超低温冰箱。

1.2主要试剂及仪器 SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBR Green)、2×Taq PCR Master Mix、细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(北京天根生化科技公司)；PCR仪、Universal Hood Ⅱ凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，ABI 3730XL基因测序仪、QuantStudio 7 Flex实时定量PCR仪(美国ABI公司)，超微量紫外分光光度计(美国ThermoFisher Scientific公司)。

1.3实验方法

1.3.1菌株处理及DNA提取 21种分枝杆菌标准菌株和200株分枝杆菌临床分离株接种于中性罗氏培养基；5种常见致病菌接种于哥伦比亚血琼脂平板。待培养至对数生长期，刮取一接种环细菌至500 μL灭菌去离子水中，煮沸15 min，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，分装后-20 ℃保存备用。

1.3.2引物设计 依据参考文献[7-8]及分枝杆菌菌种鉴定DNA序列比对系统(http://172.16.0.32:8081/NLC/pages/frame/home.jsp#)确定MA的特异序列IS1311和NTM的通用引物序列；用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)检测序列特异性，用Oligo 7.0 软件设计、评估引物，所有引物由上海生工公司合成。见表1。

表1 鸟分枝杆菌特异引物及NTM通用引物序列

1.3.3SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法的建立 总反应体系20 μL，包括2×SuperReal预混试剂增强版10 μL、10 μmol/L IS1311-3基因上、下游引物各0.6 μL、样本DNA 2 μL(终浓度为0.56 ng/μL)、50×Rox Reference Dye 0.4 μL、ddH2O 6.4 μL;阴性对照为ddH2O代替模板DNA，其余条件均相同。对21种分枝杆菌标准菌和5种常见致病菌的DNA分别加样后用涡旋振荡器振荡混匀、低温超速离心机离心数秒，再快速转至QuantStudio 7 Flex实时定量PCR仪中进行扩增。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃10 s、60 ℃(已在温度分别为59.5 ℃、59.8 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃的梯度PCR中验证为最佳退火温度)32 s(采集荧光信号)，扩增40个循环，最后熔解曲线以1.6 ℃/s的速度完成95 ℃15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃(采集荧光信号)15 s的程序。对所有标准菌株的扩增曲线和熔解曲线进行分析，以样本在30个循环内有扩增曲线、在对应熔解温度(melting temperature, Tm)出现相应的熔解峰为检出标准，判定为MA。将阳性扩增产物送生工公司进行琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带，并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化，将纯化成功样本经连接反应、转化反应后用SanPrep核酸纯化套件(质粒提取)试剂盒进行质粒提取，用即用PCR扩增试剂盒进行扩增鉴定、琼脂糖凝胶电泳，将检测成功样本进行BDT反应后置于YG96梯度PCR仪中进行扩增，扩增产物用酒精纯化后加入高度去离子甲酰胺混匀，最后转至ABI 3730XL基因测序仪进行Sanger克隆测序，结果与GenBank号为U16276.1的序列进行比对。

1.3.4普通PCR基因测序进行菌种鉴定 对21种分枝杆菌标准菌株的hsp65基因、5种常见致病菌的16S rDNA基因和200株临床分离株的hsp65和16S rDNA基因进行普通PCR扩增测序。普通PCR总反应体系50 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 25 μL、10 μmol/L上、下游引物各1 μL、样本DNA 2 μL(终浓度为0.23 ng/μL)、ddH2O 21 μL；阴性对照为ddH2O代替模板DNA，其余条件均相同。菌株DNA分别加样后使用涡旋振荡器振荡混匀，低温超速离心机离心数秒再快速转至Bio-Rad PCR仪进行扩增。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 5 min。21种分枝杆菌标准菌及5种常见致病菌的DNA各取10 μL扩增产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，同时将所有菌株扩增产物送生工公司进行琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带，并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化，将纯化成功样本进行BDT反应后置于YG96梯度PCR仪中进行扩增，扩增产物用酒精纯化后加入高度去离子甲酰胺混匀，最后转至ABI 3730XL基因测序仪进行Sanger双向测序，正反向测序片段采用DNAMAN 8软件拼接，结果用BLAST与GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中相应菌种hsp65和16S rDNA序列进行同源性分析。

1.3.5初步应用 用SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法对200株临床菌株(每个样本平行3份)进行检测，记录扩增结果。

1.4统计学分析 用SPSS 24.0软件进行。鉴定结果用株和百分率表示，用连续校正的χ2检验分析SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法鉴定出MA的百分率与以hsp65、16S rDNA基因扩增测序后鉴定出MA的百分率的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。将测序结果作为金标准，比较建立的方法鉴定MA的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和符合率。一致性用Kappa检验，Kappa<0.4，认为一致性较差；0.4≤Kappa<0.75，认为一致性一般；Kappa≥0.75，认为一致性较好。

2 结果

2.1SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法的建立

2.1.1SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法的特异性 该方法仅与MA标准菌株在30个循环内有扩增曲线，与其他20种分枝杆菌标准株、5种常见致病菌均无扩增曲线，特异性为100%。见图1。

2.1.2MA标准菌株IS1311-3扩增产物测序 将MA标准菌株IS1311-3扩增产物的测序结果与GenBank数据库中的U16276.1进行比对，其一致性为100%，见图2。说明本研究中设计的特异性引物以MA为模板可扩增出IS1311序列，扩增效果良好。

2.1.3SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法的检测限 用超微量紫外分光光度计测量MA标准菌株DNA浓度为5.6 ng/μL，将该DNA溶液用ddH2O以连续10倍等比稀释(10-1、10-2、10-3等)，用建立的方法进行检测，以在30个循环内有扩增曲线、在对应熔解温度出现相应的熔解峰为检出标准，确定SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法检出MA的最低模板浓度为5.6×10-2ng/μL，30个循环之后虽有扩增曲线，但无熔解曲线。见图3。

2.2普通PCR扩增结果

2.2.1标准菌株测序结果 通用引物hsp65扩增21种标准菌株的DNA，均获得441 bp产物(图4)；通用引物16S rDNA扩增5种常见致病菌的DNA，均获得922 bp产物(图5)。21种标准菌株及5种常见致病菌的扩增产物测序后，与GenBank数据库中相应菌种DNA比对，其一致性均在99%以上。其中，MA的测序结果与GenBank数据库中的AF281650.1比对，一致性达100%。

2.2.2200株临床分离株测序结果 经hsp65、16S rDNA扩增及测序，共鉴定出16株MA,184株非MA，包括胞内分枝杆菌100株、脓肿分枝杆菌30株、龟分枝杆菌2株、堪萨斯分枝杆菌10株、戈登分枝杆菌6株、副戈登分枝杆菌2株、偶发分枝杆菌2株、结核分枝杆菌24株、马赛分枝杆菌4株、其他分枝杆菌4株(副瘰疬分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、施氏分枝杆菌、猪分枝杆菌各1株)。

2.3两种方法鉴定临床分离株结果的比较 200株临床分离株经SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法检测，有15株在30个循环内扩增曲线阳性且熔解曲线分析均显示在87.5 ℃左右形成单一熔解峰，鉴定为MA；有185株扩增曲线阴性，鉴定为非MA。以hsp65、16S rDNA测序为金标准，评估建立的SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法鉴定MA的准确性。与测序结果相比，本法MA检出率差异无统计学意义(P>0.05)；两法符合率为99.5%(199/200)，一致性较高，Kappa值为0.965，P<0.01；在30个循环内，鉴定MA的敏感性为93.8%(15/16)、特异性为100.0%(184/184)、阳性预测值为100.0%(15/15)、阴性预测值为99.5%(184/185)。

3 讨论

我国不同地区开展的研究均表明MAC是我国主要流行的NTM[9-10]。MA是人兽共患传染病病原体[11]，在人类中可导致肺部、软组织、儿童淋巴结、皮肤感染等[12-13]。MA感染不仅在临床表现和组织病理上缺乏特异性[13]，与胞内分枝杆菌的耐药谱还存在明显差异[14]。因此，MA的菌种鉴定对确定传染源、分析传播途径、制定合理治疗方案具有重要意义。

以生化试验为主的鉴定NTM的技术，因其操作复杂、耗时长、结果准确率低的原因，现已不常使用；ELISA等血清学诊断方法用于NTM的鉴定仍处于初级阶段[15]。依据鉴定原理，目前菌种鉴定的方法有2类：一类是分析分枝杆菌组成成分差异的技术，如：高效液相色谱技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)等；一类是以PCR为基础的分子诊断技术，如：PCR-DNA直接测序技术、PCR-核酸探针技术等[16]。前者由于操作复杂、分析设备价格昂贵等原因在临床中普及受到限制。随着分子生物学技术的发展，PCR-DNA测序的方法为菌种鉴定的“金标准”[16]，为弥补单一DNA测序鉴定分枝杆菌菌种方法的不足，常联合hsp65和16S rDNA等2个及以上的分子标识以提高分辨力，但因价格昂贵，难以广泛应用于临床。基于SYBR Green Ⅰ荧光染料的PCR熔解曲线法相较于其他分子方法，如PCR-核酸探针技术、DNA芯片技术、PCR-指纹图谱等，价格更低廉、操作更简便。IS1311是仅存在于MA中的特异性插入序列[17]，对MA的鉴定和分型具有较高的诊断价值，已用于多项流行病学研究[18-19]。因此，本研究以IS1311为基础，建立基于SYBR Green Ⅰ荧光染料的鉴定MA的PCR熔解曲线方法。

IS1311是MA中含有转座酶基因的特异性插入元件。Shin等[17]研究表明，IS1311均存在于MA的4个亚种(avium亚种、副结核亚种、silvaticum亚种和hominissuis亚种)，而与之形态和生化特性相近的胞内分枝杆菌和其他NTM中均不存在IS1311。Chae等[7]也证实其诊断MA具有100%的准确性。插入序列IS1245虽被报道有较高诊断价值，但并不存在于鸟分枝杆菌副结核亚种[20]。本研究基于IS1311特异序列设计引物建立的方法在30个循环内可准确鉴定出21种分枝杆菌标准株及5种致病菌中的MA，检测MA的检测限为5.6×10-2ng/μL。

本研究选择目前应用广泛的荧光染料SYBR Green Ⅰ建立鉴定MA的PCR熔解曲线方法，具有简单、通用性好、价格低廉的优势，更有利于在临床实践中推广。值得注意的是，由于SYBR Green Ⅰ可与所有双链DNA相结合，扩增后需要进行熔解曲线分析，从而排除引物二聚体或非特异产物对测定结果的影响[21]。本研究在60 ℃的最佳退火温度下，对IS1311-3扩增后的产物进行熔解曲线分析，结果显示为单峰(Tm值87.5 ℃)，无二聚体或非特异产物出现。

通过优化退火温度，IS1311-3扩增鉴定MA标准菌株时，在30个循环内出现扩增曲线；同样条件下鉴定除MA之外相同浓度或更高浓度的20种NTM和5种常见致病菌时，均未在30个循环前出现特异性扩增曲线，同时在30个循环后出现特异性扩增曲线的样本无相应Tm值的熔解曲线。因此本研究选择在30个循环内出现特异性扩增曲线及在87.5 ℃左右出现相应熔解峰的实验结果为最终判定标准，建立鉴定MA的SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法。

建立的方法在包含14种分枝杆菌的200株临床分离株中鉴定出MA的比率与测序结果相比差异无统计学意义(P>0.05)；与测序结果的一致性较高，Kappa值>0.75，P<0.01。说明本研究中建立的SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法对MA具有较高的诊断准确性。本法敏感性为93.8%，特异性为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为99.5%。与其他以16S rDNA、hsp65、16S-23S rDNA内转录间隔区为靶标鉴定临床分离株的结果(93.9%，169/180)[22]一致，与基因芯片法特异性(98.9%)相似，敏感性(80.0%)稍高[23]。SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法以DNA为检测靶标，更加稳定，且IS1311在基因组中有6～8个转座酶基因拷贝[24]，与16S rDNA在活菌内的拷贝数相当，较高于hsp65、rpoB的拷贝数，可提高检测的灵敏度，具有检测临床样本中MA的潜力。

本研究也存在局限，建立的SYBR Green Ⅰ荧光PCR熔解曲线法在标准菌株中能很好地鉴定MA，但应用于临床菌株时，未能将其完全检测出，重复实验后发现该菌的扩增曲线始终在30～32循环之间，将扩增产物进行Sanger双向测序后的序列与U16276.1比对为100%。分析其原因可能与该菌和MA标准菌的IS1311拷贝数有差异，导致其扩增循环数较大有关。因此，在30个循环左右出现扩增曲线及在87.5 ℃左右出现熔解峰的菌疑似MA，需进一步测序验证。此外，目前建立的该方法仅初步用于临床菌株的鉴定，下一步将继续完善，从而能直接应用于临床样本的检测。因此，未来需大样本临床检测，来验证该方法的诊断准确性。

基于SYBR Green Ⅰ建立的鉴定MA的荧光PCR熔解曲线法具有特异、敏感的优势，且该技术操作简单，对于缺乏经验的实验技术人员培训后即可开展实验，更易于在临床中推广。