田鹏鹏，王娴默，伍嘉豪，王立，范文，朱丽莎(长江大学附属第一医院检验科，湖北荆州 434000)

2019年12月，武汉暴发新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情[1-2]，给公共卫生防控和临床诊治带来巨大挑战。目前COVID-19尚缺乏特效治疗，早发现、早诊断、早隔离、早治疗具有十分重要的意义，但目前确诊主要依据新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测，由于标本采集与存放、检测灵敏度、病毒感染部位等各方面因素，易出现假阴性结果[3-4]。因此，新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)[5]中指出，当疑似病例中血清SARS-CoV-2特异性IgM抗体和IgG抗体阳性、IgG抗体滴度恢复期较急性期有4倍及以上升高也可确诊，故需要血清学抗体检查来辅助诊断COVID-19。为了评估新型冠状病毒特异性IgM/IgG抗体的诊断价值，特对本院中确诊、疑似以及其他患者的抗体水平进行研究，具体如下。

1 资料和方法

1.1一般资料 收集2020年1月1日至3月13日在长江大学附属第一医院住院的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)确诊患者108例，男53例、女55例，年龄(53.0±18.9)岁；疑似患者23例，男10例、女性13例，年龄(43.0±6.4)岁；排除COVID-19的其他肺部感染住院患者20例，男11例、女9例，年龄(55.0±10.4)岁；其他疾病患者15例，男9例、女6例，年龄(63.0±16.5)岁，包括糖尿病3例，心肌梗死4例，急诊外科手术8例；看护COVID-19患者的健康医务工作者55例，男26例、女29例，年龄(36.5±12.5)岁。对所有研究对象均进行SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体检测和核酸检测。

1.2诊断标准 所有患者均符合国家卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中COVID-19诊断标准。疑似病例：结合流行病学史和临床表现综合分析。确诊病例入院时的临床分型：(1)轻型：临床症状轻微，影像学检查未见肺炎表现。(2)普通型：具有发热、呼吸道等症状，影像学检查可见肺炎表现。(3)重型，符合下列任何一条：出现气促，呼吸频率≥30次/min；静息状态下，手指血血氧饱和度≤93%；动脉血氧分压(PaO2)/吸氧浓度(FiO2)≤300 mmHg。(4)危重型，符合下列任何一条：出现呼吸衰竭，且需要机械通气；出现休克；或合并其他器官功能衰竭需ICU监护治疗。

1.3主要仪器和试剂 iFlash3000i化学发光测定仪(亚辉龙公司),ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；SARS-CoV-2 IgG抗体和IgM抗体检测试剂盒(化学发光法，亚辉龙公司)，2019新型冠状病毒(ORF1ab/N基因)核酸检测试剂盒(上海伯杰公司)。

1.4SARS-CoV-2 IgM抗体和IgG抗体检查 将新鲜抽取的患者血液样本加入红色无抗凝剂试管中，室温静置后进行离心，严格按照仪器和试剂盒操作说明书进行SARS-CoV-2 IgM抗体和IgG抗体检测。抗原成分为SARS-CoV-2抗原(重组蛋白)，更换批号时使用校准品校准。统计分析时以IgM≥10 Au/mL、IgG≥10 Au/mL为阳性，IgM<10 Au/mL、IgG<10 Au/mL为阴性。

1.5SARS-CoV-2核酸检测 采集患者的咽拭子，用双重荧光RT-PCR法进行检测。靶标一ORF1ab基因正向引物(F)：5′-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3′；反向引物(R)：5′-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3′；荧光探针(P)：5′-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAG

GTTATGG-BHQ1-3′。 靶标二N基因正向引物(F)：5′-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3′；反向引物(R)：5′-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3′；荧光探针(P)：5′-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3′。核酸检测阳性判读标准：同一份标本中病毒ORF1ab和N基因检测同时阳性；同一患者不同的2份标本中病毒ORF1ab或N基因检测阳性。每次核酸检测均同时进行阴性质控和阳性质控。

2 结果

2.1COVID-19患者的一般临床资料 COVID-19患者共108例，年龄范围4个月～89岁，人群普遍易感；首发症状主要是发热(65.7%)、咳嗽(37.0%)、乏力(15.7%)；无症状患者共4例(3.7%)，其中1例是肿瘤复查肺部CT而确诊，3例是密切接触者筛查而确诊。普通型患者与重型/危重型患者临床资料比较结果见表1。

表1 COVID-19患者的一般临床资料[n(%)]

2.2SARS-CoV-2核酸检测结果 108例确诊患者核酸检测均为阳性，23例疑似患者、45例非COVID-19患者及55例看护人员核酸检测均为阴性。

2.3SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体检测结果 在108例COVID-19确诊患者中IgM单一阳性率为64.8%，IgG单一阳性率为93.5%，IgM或IgG任一阳性率为98.1%。以RT-PCR结果为比对标准，IgM/IgG任一阳性的敏感性为98.1%、特异性为89.4%、准确性为93.7%、阳性似然比为9.24，阴性似然比为0.02。见表2。在23例疑似COVID-19患者中5例IgM阳性，6例IgG阳性，共6例IgM或IgG任一阳性；在45例非COVID-19患者和55例看护人员中，3例IgM阳性，5例IgG阳性，共6例IgM或IgG任一阳性。

表2 SARS-CoV-2特异性IgG和IgM抗体的方法学评价

2.4不同型别之间抗体阳性率的差异 普通型和重型/危重型COVID-19患者之间，IgM/IgG阳性率差异无统计学意义(χ2=1.933，P=0.525)。

2.5同一患者不同时间段抗体水平比较 通过对有限的患者进行比较发现，出院后第14天COVID-19患者血清IgG水平比出院当天下降，差异有统计学意义(t=12.087，P=0.001)，但IgM水平无明显变化(t=1.395，P=0.257)。对比出院后第14天和第16天的IgM(t=1.610，P=0.142)和IgG(t=1.015，P=0.336)，二者差异无统计学意义，但是第28天相比第26天，IgM(t=2.794，P=0.049)和IgG(t=26.902，P=0.000)水平下降，差异有统计学意义。见表3。

表3 同一患者不同时间段抗体水平的变化

3 讨论

从COVID-19暴发以来，国家卫生健康委员会在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》试行第1～6版中确诊病例的实验室证据都是核酸检测或测序证实，但是临床检验科常用RT-PCR检测病毒核酸，受各种因素影响，易造成假阴性结果，而且在条件有限的实验室还不能常规开展，严重影响确诊或排除COVID-19。故新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)明确提出，SARS-CoV-2特异性IgM抗体和IgG抗体检测也可作为确诊依据之一。血清特异性抗体检测有标本更易标准采集、操作简便、耗时更少、设备条件要求不高等优势，更易在临床实验室开展。机体免疫系统是抵御病原体入侵的重要防线，当SARS-CoV-2病毒入侵后，其特定蛋白如S蛋白和N蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答，最早出现的抗体是IgM及其后的IgA抗体，然后是IgG抗体。按照急性感染的一般过程，当IgG抗体出现后，浓度会持续增高，IgM则会持续降低直至消失，IgG抗体会较长时间存在。因此我们需要同时检测血清特异性IgM抗体和IgG抗体，COVID-19作为新发的传染病，其抗体检测的临床诊断价值还有待进一步研究。

本研究患者的一般临床资料与试行第七版中描述一致。我们以RT-PCR核酸检测结果为比对标准，评估SARS-CoV-2特异性IgM/IgG抗体联合检测的临床敏感性、特异性、准确性分别为98.1%、89.4%、93.7%，与梁颖[6]、徐万洲[7]等研究结果一致，但敏感性更高，与临床确诊病例有很好的一致性。此外特异性IgM抗体/IgG抗体阳性率与疾病的分型无关，与罗效梅等[8]结果相同，符合免疫学规律。但本研究中IgG阳性率要高于IgM，与徐万洲等[7]研究结果更相近，可能原因是由于特异性抗体检测试剂盒研发应用较晚，我们收集的病例多是处于中晚期或者恢复期，甚至一部分是治愈出院的观察期患者，故本研究中IgG抗体阳性率高于IgM。

本研究使用化学发光法检测血清抗体，在临床标本中的一些干扰物质会导致假阳性结果，如溶血、脂血、微生物污染、出现凝块或絮状物等情况。本研究中看护的健康医务工作者55例和其他病毒性肺炎20例各有1例出现IgG阳性，无IgM阳性，但在其他疾病15例中出现了IgM/IgG阳性4例，特别是2例有精神疾病和癫痫病史的IgM水平特别高(>200 Au/mL)，提示有特定病史可能会导致异常结果，另外特异性抗体检测用于疑似人群筛查时，应关注其假阳性的问题，避免带来不必要的混乱。有6例疑似COVID-19患者IgG阳性(IgG几乎都>100 Au/mL)，同时其中5例IgM阳性，很大可能是因为其处于COVID-19急性期但各种原因导致核酸检测假阴性，复测核酸仍然是阴性，未进行抗体复测。另外IgG和IgM均阴性的疑似患者17例，未追踪后续抗体和核酸检测结果，若间隔一周再次抗体检测仍为阴性则基本可以排除COVID-19。有2例COVID-19确诊患者，但是其IgM/IgG均是阴性，表明其抗体检测由于窗口期的存在，仍然存在假阴性的可能。故核酸RT-PCR检测联合特异性IgM/IgG抗体动态检测，可以更准确地诊断或排除COVID-19。

借助有限的几个COVID-19病例研究，发现出院后第14天的IgG抗体水平比出院当天显著下降，IgM下降不明显，出院后第28天比第26天的IgM和IgG水平均明显下降，说明其抗体水平的变化与时间存在一定的相关性，关于IgM和IgG抗体产生、消失的规律变化还有待更进一步的研究。

综上所述，COVID-19患者主要症状是发热、咳嗽、乏力，不发热和无症状的患者也有相当一部分，值得关注。SARS-CoV-2特异性IgM抗体/IgG抗体可以联合SARS-CoV-2核酸检查，提高COVID-19诊断的敏感性和准确度，有必要进一步研究血清中抗体的变化趋势，以更好地用于COVID-19诊断和治疗。