陈振华，张小萍，余艳艳，刘昭国，谭云洪(湖南省胸科医院检验科，长沙 410013)

提高结核病患者检出率是我国结核病防治重点关注的领域之一，该病最直接有效的证据是从患者痰等标本检出结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)[1-2]。MTB培养法具有操作较简单、易推广的优点，但是培养时间长、阳性率不高；分子生物学检测方法克服了培养法的不足，能够快速、敏感地检测出MTB和(或)其耐药性[3]，为结核病的早诊断、早治疗提供新的途径。我国“十三五”全国结核病防治规划要求大部分县、市级定点医疗机构除开展涂片镜检外，还需开展分枝杆菌培养和分子生物学检测项目。本研究对我院分枝杆菌固体培养(Lowenstein-Jensen culture，L-J)、实时荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、线性探针杂交(line probe assay，LPA)和GeneXpert MTB/RIF(GeneXpert)检测MTB及其耐药性的临床结果进行对比分析，探讨其临床应用价值。

1 材料和方法

1.1研究对象 连续收集湖南省胸科医院2018年5月至2019年11月初诊肺结核疑似患者347例(A组)和活动性肺结核患者172例(B组)。A组患者中位年龄49岁，其中男性230例(占66.3%)；B组患者中位年龄58岁，其中男性122例(占70.9%)。肺结核的诊断按照《WS 288-2017 肺结核诊断》采用综合诊断的方法[4]。A组347名患者采集其痰标本分别进行L-J、FQ-PCR和LAMP检测；B组172名患者采集其痰标本分别进行L-J及MTB绝对浓度法固体药敏试验、LPA和GeneXpert检测。同一患者所有痰标本均为同一天留取，每份痰标本体积约3 mL，盛于具有螺纹盖的广口痰杯中，每份痰标本随机进行相应检测。不能立即检测的痰标本4 ℃保存，时间不超过3 d。

1.2主要仪器及试剂 罗氏培养基和药敏培养基、对硝基苯甲酸(PNB)培养基和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基(珠海贝索公司)，MPB64抗原检测试剂盒(杭州创新生物检控公司)，FQ-PCR检测试剂盒(中山达安公司)，LPA检测系统及配套试剂盒(德国LPA Life Science公司)，ABI 7500 PCR仪(美国ABI公司)，LAMP检测系统及配套试剂盒(广州迪澳生物科技公司)，Life Touch基因扩增仪(杭州博日公司)，全自动GT-Blot 48杂交仪(法国生物梅里埃公司)，GeneXpert检测系统及配套Xpert MTB/RIF试剂盒(美国Cepheid公司)。

1.3L-J及MTB绝对浓度法固体药敏试验 按照《结核病实验室检验规程》[5]，将痰液用等体积40 g/L NaOH消化处理15 min，取0.1 mL接种至酸性罗氏培养基中。每周观察1次培养基，发现菌落生长后挑取菌落进行涂片抗酸染色、MPB64抗原检测、PNB生长试验和TCH生长试验，鉴定菌种，具体操作按照试剂盒说明书进行；2个月未见菌落生长报告阴性。如果发现培养基液化或者长霉菌，则报告污染。MTB绝对浓度法固体药敏试验：用接种环刮取MTB新鲜菌落于盛有生理盐水的磨菌瓶中，旋涡震荡2 min，比浊制备成1 mg/mL菌悬液，生理盐水稀释成10-2mg/mL菌液，吸取100 μL分别接种至对照、含高浓度和低浓度利福平培养基表面，培养4周后判读结果：对照培养基上菌落生长良好的前提下，含药培养基上生长的菌落数多于20个，判定为耐药。

1.4FQ-PCR检测 视标本性状加入1～2倍体积4% NaOH溶液，震荡混匀后，静置液化15 min，取液化后样本1.0 mL于1.5 mL离心管，12 000 r/min 5 min，弃上清液，加入1.0 mL无菌生理盐水重悬，12 000 r/min 5 min，弃上清液，向每支离心管中加入50 μL核酸释放剂，金属浴100 ℃ 10 min，12 000 r/min 5 min，上清液为待测样本DNA。取模板DNA 2 μL加入PCR反应管中，按照说明书中扩增程序在ABI 7500 PCR仪上扩增，按照试剂盒说明书判读结果：检测样品扩增曲线呈S形且循环阈值(Ct值)<30，报告为“检出结核分枝杆菌DNA”。

1.5LAMP检测 用一次性吸管吸取200 μL痰液加入样品管中，金属浴100 ℃ 10 min，然后将样品管旋入吸附过滤管中进行核酸提取、富集、纯化。取模板DNA 2 μL加入对应的荧光PCR反应管中，在迪澳恒温荧光检测仪Deaou-308C上检测，按照试剂盒说明书判读结果：检测样本扩增曲线呈S型曲线且出峰时间≤45 min，报告为“检出结核分枝杆菌DNA”。

1.6GeneXpert检测 视标本性状加入1～2倍体积标本处理液，震荡混匀，静置15 min后，吸取2 mL液化标本于Cartridge反应盒，将加好标本的Cartridge反应盒放入GeneXpert检测仪内，开始自动检测，反应结束后在检测系统窗口下直接观察测试结果。在检出MTB DNA的前提下报告利福平耐药结果。

1.7LPA检测 视标本性状加入1～2倍体积40 g/L NaOH溶液，震荡混匀后，静置液化15 min，将消化好的液体转移至50 mL离心管中，加无菌生理盐水至45 mL；4 000 r/min 20 min，弃上清液，每管加2 mL无菌生理盐水混匀沉淀，取1 mL混悬液转移到1.5 mL离心管中，12 000 r/min 5 min，弃上清液，加入100 μL裂解液(A-LYS)，金属浴95 ℃ 5 min，瞬间离心；加入100 μL中和缓冲液(ANB)，混匀，12 000 r/min 5 min，上清液即为提取的核酸DNA。按照说明书，取模板DNA 5 μL加入PCR反应管中，在Life Touch基因扩增仪上扩增，扩增完成后取20 μL扩增产物用全自动GT-Blot 48杂交仪杂交。按照试剂盒说明书判读MTB及利福平检测结果。

1.8统计学分析 用SPSS 20.0进行。组间率的比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。2个方法检测结果的一致率以Kappa值表示，Kappa≥0.75为一致性较好，0.75>Kappa≥0.4为一致性一般，Kappa<0.4为一致性较差。

2 结果

2.1患者痰标本检测阳性率 各方法单独检测和将L-J联合分子生物学检测的病原学阳性率结果见表1。可疑肺结核患者3种方法检测阳性率间差异无统计学意义(χ2=4.75，P=0.093)，与单独采用L-J相比，L-J+FQ-PCR或者L-J+LAMP阳性率均明显提高，差异有统计学意义(χ2分别为11.59和4.42，P<0.01)；活动肺结核患者3种方法检测阳性率间差异无统计学意义(χ2=5.05，P=0.080)，L-J+LPA病原学阳性率高于单独采用LPA的阳性率(χ2=7.86，P<0.01)，L-J+GeneXpert病原学阳性率高于单独采用L-J的阳性率(χ2=9.84，P<0.01)。

表1 两组患者痰标本病原学阳性率

2.2A组各方法间检测结果的一致率 A组347例患者痰标本进行3种方法单独检测，均为阴性224例，均为阳性51例，总一致率为79.3%(275/347)。其中，L-J与FQ-PCR的一致率为84.1%(292/347)，L-J与LAMP的一致率为87.6%(304/347)，FQ-PCR与LAMP的一致率为86.7%(301/347)，Kappa值分别为0.583、0.643和0.656，见表2。

表2 A组3种方法间病原学检测结果的一致率

2.3B组各方法间检测结果的一致率 B组172例患者痰标本进行3种方法单独检测，病原学均为阴性63例，均为阳性50例，总一致率为65.7%(113/172)。其中，L-J与LPA的一致率为72.7%(125/172)，L-J与GeneXpert的一致率为75.0%(129/172)，LPA和GeneXpert的一致率为83.7%(144/172)，Kappa值分别为0.446、0.504和0.678，见表3。3种方法病原学检测全为阳性结果的50份痰标本，利福平耐药性结果显示，3种方法检测结果全为敏感的25例，全为耐药的22例，总的一致率为94.0%(47/50)。

表3 B组3种方法间检测结果的一致率

3 讨论

目前，我国较多的结核病定点医疗机构采用的方法是联合直接涂片、L-J和分子生物学技术筛查MTB。本文结果显示，A和B两组患者用L-J和分子生物学技术检查痰标本，各组内3种方法总的病原学阳性率差异均无统计学意义。本研究中L-J、LAMP、LPA和GeneXpert检测的病原学阳性率均低于杨健等[6]报道结果，FQ-PCR的病原学阳性率与张帆等[7]报道结果接近。可能的原因：本研究纳入的研究对象与其他文献选取的研究对象不完全一致；各方法使用的仪器、试剂盒厂家与其他文献报道也存在差异；本研究各方法检测的痰不是同一份标本，而是患者留取3份痰标本分别进行L-J和分子生物学检测，符合临床工作实际。

A组3种方法检测结果两两之间总的一致率均在84%以上，B组3种方法检测结果两两之间总的一致率均在72%以上。与A组相比，B组病原学检出结果的一致性低，差异产生的原因可能由于B组患者中复治患者占44.8%，在此类患者标本中可能存在死亡的MTB导致培养阴性而MTB DNA检测阳性。各方法检测结果不一致的主要原因有：痰标本中MTB含量低于L-J的检出限，分子生物学技术灵敏度更高；不同分子生物学检测方法针对基因靶点不同，当标本中MTB载量较低时，易出现不一致结果；不同的检测系统受外界因素影响大小不同。

LPA和GeneXpert在临床应用较多[6-9]，2种方法既能快速检测标本是否存在MTB-DNA，还能检测利福平耐药性。本研究对L-J与LPA、GeneXpert病原学检查均阳性的50份痰标本，进行MTB利福平耐药性检测，仅3例药敏结果不一致，LPA、GeneXpert均表现耐药，L-J均表现敏感，其中2例为复治患者，1例初治患者。查阅3例患者GeneXpert的原始资料，MTB核酸检测结果均是中或者高量级。可能是标本中同时存在敏感和耐药菌株，培养过程中敏感菌株优势生长导致耐药菌株比例降低，出现表型药敏假阴性结果[10]。

综上所述，临床采用多份痰标本进行MTB病原学多个项目检测，各项目之间均具有可接受的一致性，分枝杆菌L-J联合分子生物学技术检出病原学阳性率比采用单一技术(培养或者分子生物学)阳性率高。L-J与LPA、GeneXpert利福平药敏结果一致性好。各县、市级定点医疗机构应根据实际情况，开展适宜的联合检测技术以达到《“十三五”全国结核病防治规划》的目标。