王 蕾，杨宝良，魏 威，周 培，刘海生，李润乐，汤 锋*

(1.青海大学高原医学研究中心，青海省高原医学应用基础重点实验室，青海 西宁 810001；2.青海省红十字医院，青海 西宁 810001；3.青海大学基础医学部，青海 西宁 810001；4.青海大学研究生院，青海 西宁 810001)

亮氨酸氨基肽酶是一种金属肽酶，它在微生物、哺乳动物和植物中广泛存在并具有特定的作用[1]；M17氨基肽酶家族(M17-LAP)被证实它在许多寄生虫感染中起到了保护宿主的作用。在寄生虫感染过程中，寄生虫来源的蛋白酶是影响寄生虫生理功能和致病性的关键因素，如蛋白质分解代谢、营养物质获取和寄生虫在宿主体内的迁移、组织入侵、免疫逃避及在宿主体内的存活等[2]。这些蛋白酶已被开发为控制各种寄生虫感染的靶点药物、候选疫苗和血清诊断标志物。因此本研究主要通过构建pCzn1-LAP质粒表达蛋白，通过分离纯化获取目的蛋白为后续多房棘球蚴LAP行优势抗原表位鉴定，及评价LAP对多房棘球蚴感染是否具有保护作用奠定基础。行酶学作用条件分析可为研制抗虫药物和疫苗提供有价值的应用信息。

1.材料与方法

1.1 主要试剂

pCzn1质粒(钟鼎生物公司)，限制性内切酶(TaKaRa公司)，蛋白质Marker(Thermo公司)，IPTG(Sigma公司)，质粒小提试剂盒(AXYGEN公司)，大肠杆菌BL-21感受态细胞(钟鼎生物公司)，氨苄青霉素钠(Solarbio公司)，MD34透析袋(Solarbio公司)，Ni2+IDA亲和层析柱(Novagen公司)。亮氨酸对硝基苯胺(Sigma公司)，甘氨酸(Amresco公司)。

氯化物为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 pCzn1-LAP质粒构建

参照文献方法实验[3]。LAP蛋白的氨基酸序列通过NCBI-GenBank网站获取，序列号为CDS36608.1，含有1796个碱基，编码519个氨基酸，蛋白质理论分子量大小为57 KD。利用OptimumTMCodon软件进行密码子优化，获得最优的碱基序列(适合蛋白质原核表达)[4]。采用基于PCR精确合成的方法，设计全长拼接引物合成LAP基因，添加两个酶切位点，并在引物的两端分别设计了保护性碱基，连入载体pCzn1。将获得的重组质粒pCzn1-LAP转入BL-21克隆菌株，将阳性产物进行测序并进行序列比对。主要酶切鉴定体系组成包括质粒3 μL，内切酶NdeI和XbaI各0.25 μL，10×Buffer 1 μL和DDW 10 μL。

1.2.2 质粒转化

提取阳性菌株的质粒后进行转化实验。将16 μL的IPTG(50mg/mL)和40 μL的X-gal(20mg/mL)加入预先准备的LB固体培养平板(Ampicillin 50μg/mL)中，用玻璃珠均匀涂布，在37 ℃恒温箱静置1 h[4]。将3 μL的pCzn1-LAP质粒加入60 μL的BL-21感受态细胞中，轻弹混匀后放入冰盒30 min，于42 ℃热激90 sec后迅速置冰中5 min，加入300 μL的LB液体培养基，于37 ℃恒温箱培养1 h[5]。培养完成的菌液均匀涂布于上述固体平板，在37 ℃恒温培养箱内倒置培养(过夜)，10 h后从平板中挑取单个白色阳性菌置于5 mL的LB液体培养基(Ampicillin 50μg/mL)中发酵[5]，将用12%SDS-PAGE电泳验证后的菌液加入甘油置-80 ℃冰箱储存。

1.2.3 LAP原核表达及纯化

利用低压层析系统进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化，用PBS冲洗(恒流泵流速设置为30左右)平衡柱至OD280值为0。蛋白样品加入已经平衡好的亲和层析柱，用Washing-Buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑，8M尿素。pH8.0)洗脱杂蛋白[3]，用Elution-Buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaH2PO4，250mM咪唑，8M尿素。pH8.0)洗脱并接收LAP蛋白[3]。用PEG20000浓缩蛋白至淡黄色时行电泳分析[3]。

1.2.4 LAP酶学特征分析

以Leu-pNA为底物测定LAP酶活性，在405 nm处测定吸光度值的大小(代表酶活性的大小)[6]。在不同的缓冲液中(甘氨酸缓冲液pH 2.7、磷酸钠缓冲液pH 4.5～7.5、Tris-HCl缓冲液pH 8.0～10.0和1M Tris-HCl缓冲液pH 10.5～11.0)行最适pH值测定[7]。在96孔板中，加入80 μL的LAP蛋白、20 μL的Leu-pNA(10mM)，再加入100 μL的缓冲液，于60 ℃条件下孵育2 h。对照组用等量的纯水代替LAP蛋白。最后将96孔板置于冰上冷却10 min使反应停止，用酶标仪测定405 nm处的吸光度值。

观察4 ℃～75 ℃间LAP最佳酶活性温度条件。在96孔板中，加入80 μL的LAP蛋白、20 μL的Leu-pNA(10mM)，再加入100 μL的50 mM的Tris-HCl缓冲液(pH=9)，不同温度条件下孵育2 h。对照组用等量的纯水代替LAP蛋白。

将10 mM不同的金属氯化物(包括BaCl2、CaCl2、CoCl2、MnCl2、MgCl2、ZnCl2)分别加入到反应体系中，测定金属离子对LAP酶活性的影响[7]。在96孔板中，加入80 μL的LAP蛋白、10 μL的不同金属氯化物，再加入90 μL的50 mM的Tris-HCl缓冲液(pH=9)，于30 ℃条件下孵育30 min，最后加入20 μL的Leu-pNA(10mM)，于60 ℃条件下孵育2 h。对照组用等量的纯水代替LAP蛋白。

1.2.5 统计学处理

测定不同金属离子对LAP酶活性大小的影响时，实验组与对照组的比较采用独立样本t检验，P<0.05被认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 pCzn1-LAP测序及比对结果

将重组质粒pCzn1-LAP转入BL-21克隆菌株，挑取的阳性克隆子的测序结果和预期序列完全一致。图1为部分测序比对结果。测序结果拼接如下所示，单划线区域为LAP基因区域，黄色区域表示酶切位点。

TCGTAGTGCACATTCCTTTAACGCTTCAAAATCTGTAAAGCACGCCATATCGCCGAAAGGCACACTTAATTATTAAGAGGTAATACACCATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGTCCCACATCCTTCTTATGTACCTTAAGAGCTGCTCACGTATCGCTGATGCTGACTGCGATATCGTTGTCTTCGTGAATGACGCAATTCGCTCTCTGGGATCGTCTCTTTTTGCCCTGGAACAGGCCCTTGCCGTCTTTGAAAAGGTTAATCCGAAATTATCGGAGAGTTGCGATCTTATTCCATTCCCAAATCATCCGTGTCAGCGTCTGATTTTCGCACCCACCGGAAAGCTGGATGGGGATACAGCCGACAGCCGTAATATTTCGGATGCCGCGTTTAAGGCTATCAAGATGGCGCATTGCATCGGGTGCCGCCGTCCTTTATTAGTTCTTGGCGGGATCGCAAGTGGACCCAAGGACGCCTTATGGATGGAGAGCGAATTCCCGTTGTTGAACGCTATCTTAGGTGCTCTGCATGCCTTATATAATCCCTTAGAACTGTGCGAAGCGTTCCCGGAGAAGGCGCGTAAGTTTGACAACTTGTTGGTTTTCGGAGCATCGGAACGCATTTTGCGCGTTGCGTATGCTATGGAAGAAGGTCGCCGTGTTGCTCGTGACATCGCCGGGAGTGACCCAGAACGCATGAGTGCTCCTCGCATCGTGGAGTATCTGAAGCGCGAGTTTGCCAGCACGCCAGAGGTCATTATGCATGTTAAAGAAATCGACACGTCCGCATACCCGTTAATTGCTGCTGTGAATCGTGCGGCGAGTGGCGTTGAACGTCATAATGGAAAAGTAGTACACCTTACCTATGAGGGCGGCTCCCCGGTCGATACTACTTTATTTCTGATCGGCAAAGGAATTACGTATGATACCGGCGGCACCGATGTGAAGGCTGGAGGCGTTATGGCCGGAATGCATCGTGACAAAAGTGGAGCCGCAGCTGTCGCGGGTTTTTTCCGCACTTTGTCCCTTCTTAAACCGAAGGGTCTTTCCGTTCATGGAGCTATGGCTCTTGTACGCAATTCAATTGGATGTGACGGTTATGTCGCCGACGAAATCATTACGTCCCGTGCCGGACGCCGCGTACGCGTGGGAAACACGGATGCTGAGGGTCGCATGGTAATGACCGACTTATTATGCGAGGCTAAAGAACAGGCAATGAATGCGGTGAACCCATTTTTGTTCACATTTGCTACATTAACGGGTCATGCTGCGCTGGCATATTCCTGCTATACCGCGATCATGGATAATGGCCCCGCGCACAAGCAGGGGGTTGCTTCGGACCTTCAGCGCGCAGGTGACCAAGTCTCAGATATGGCCGAGATTTCTACAATCCGCCGCGAGGACTACGAAGCTGTAAAGGGACACTCGGAGTACGAAGACTTGCTGCAATGCAATAATCTGCCCAGTTCCGCCACCCCACGCGGTCACCAGTTTCCGGCCGCATTTATGATTGCGGCAAGTGGTCTTGATGAGCACGGGTTAGGCTCGGAACAAAAACATTTACCCTACACTCACCTTGATATCGCCGGGAGCGCCGGTGCTATTGATGTATTACCCACAGGCGCTCCCTTACTGATGTTTACCTCCATGTACATCCTGCCCCGCCTTTAATCTAGATAGGTAATCTCTGCTTAAAAGCACAGAATCTAAGATCCCTGCCATTTGGCGGGGATTTTTTTATTTGTTTTCAGGAAATAAATAATCGATCGCGTAATAAAATCTATT

图1 pCzn1-LAP测序结果图

2.2 酶切鉴定PCR结果

pCzn1-LAP质粒经过酶切后，PCR扩增结果如图2所示。与质粒酶切前DNA扩增电泳结果比较，酶切后在4.4 Kbp大小左右处出现了清晰明亮的目的条带，说明质粒的双酶切成功。

M：DNA Marker；1：酶切前的质粒；2：酶切后的质粒

2.3 载体构建图谱

重组质粒pCzn1-LAP载体构建图谱如图3所示。图3显示该质粒具有氨苄青霉素抗性。此发现为下一步原核蛋白表达研究提供了前置条件。

2.4 LAP表达及纯化结果

LAP蛋白的原核表达系统成功建立，通过IPTG诱导后，菌液表达产量大幅增加，沉淀中表达的蛋白比上清液多(图4)。通过亲和层析柱后蛋白获得纯化，LAP蛋白的分子量为57 KD(含组氨酸标签)(图5)。

图3 pCzn1-LAP质粒载体构建示意图

M：Marker；1：未诱导；2：诱导后；3：0.5 mM IPTG诱导上清；4：0.5 mM IPTG诱导沉淀

M：Marker；1：未纯化；2：洗脱液中的蛋白；3：目的蛋白

2.5 LAP酶学特征分析结果

LAP蛋白酶活性最适pH在7.5～9.0间，当pH为9.0时LAP酶活性最高(图6A)。LAP蛋白酶活性最适温度在45 ℃～60 ℃间，当温度为60 ℃时LAP酶活性最高(图6B)。与对照组比较，LAP实验组不同金属离子对其活性均有影响(P<0.001)。当Co2+、Zn2+存在时，LAP酶活性显著增强；不同金属离子对酶活性影响大小排序为Co2+>Zn2+>Ca2+>Mn2+>Mg2+>Ba2+>K+(图6C)。

A：pH的影响；B：温度的影响；C：金属离子的影响

3.讨论

重组蛋白的表达与纯化在基础医学和药学研究等领域占有重要地位，重组DNA技术通过简单的修饰能够改变蛋白质的稳定性、活性和功能，通过亲和标记可以促进蛋白质纯化[8]。研究表明密码子基因优化后的蛋白质更利于表达且产量高[9]。本研究采用基因合成方法利用遗传密码子的偏爱性优化来促进重组靶蛋白LAP的表达。我们发现LAP以包涵体形式表达，因此需要通过复性步骤以及优化培养条件(包括诱导剂浓度、诱导培养时间和温度)减少包涵体生成。本实验最终选定IPTG诱导浓度为0.5 mM，培养温度为37 ℃，诱导时间为4 h。

通过酶学特征分析发现，多房棘球蚴抗原LAP具有M17-LAP家族的特点，可以与亮氨酸特异性底物Leu-pNA发生反应。研究表明，M17-LAP通过金属离子与活性位点结合发挥效应[10]，通过测定不同金属离子对LAP酶活性影响，能够为后续研究其活性位点、底物/抑制剂结合模式和作用机制奠定基础。本实验结果显示，Co2+、Zn2+存在时，LAP酶活性提高，说明它是金属依赖型蛋白酶。对蛋白晶体结构的研究显示，Zn2+在M17-LAP活性位点中起到了调节和催化作用[11]，Zn2+是否结合LAP的活性位点发挥作用尚需验证。目前关于LAP酶活性的最适pH值和最适温度大部分集中在8.0～9.5和45 ℃～75 ℃之间[6，7，12]，本实验测定的多房棘球蚴LAP的最适pH和最适温度结果也在此范围内，说明它具有一定的耐高温的能力，不易发生降解。由此推测在碱性和高温环境下可能有利于LAP疏水核与N末端未质子化的底物之间相互作用，从而促进底物的水解。上述多房棘球蚴LAP酶学特征的相关研究结果可能为后续寻找其活性位点和金属离子结合位点的关键特征，以及研究侧链基团的功能、抑制剂结合模式奠定基础。

本实验通过将多房棘球蚴抗原LAP的重组基因与表达载体pCzn1相连接，将其转入大肠杆菌BL-21菌株中进行表达，成功构建了LAP的原核表达系统。LAP融合蛋白通过Ni柱亲和层析后纯度变高。酶活性分析证实，多房棘球蚴LAP属于M17-LAP家族，LAP可以作为药物治疗或疫苗干预的一个有吸引力的靶点。