张 辉，李爽林，马 强，杨应忠，李 琳

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.青海大学附属医院，青海 西宁 810001；3.青海大学研究生院，青海 西宁 810016)

先天性心脏病(Congenital heart disease，CHD)是由遗传因素和环境因素单独或两者共同作用引起的。西宁属高海拔地区，CHD的总患病率为1.15%，明显高于我国平原地区(0.13%～0.35%)[1]。徐等[2]的调查显示，青海省CHD的发生率高于国内平原地区，并且随海拔的升高，CHD检出率增高。TBX5是影响心脏发育的重要影响因子之一，其位于染色体12q24区，是T-box转录因子家族的成员，具有8个外显子，可编码518个氨基酸[3]。本研究通过对研究对象TBX5的所有外显子进行测序和分析，探讨TBX5突变与西宁地区汉族人群先天性心脏病的相关性。

1.对象与方法

1.1 研究对象选择

收集2016年至2019年就诊于青海大学附属医院的220例西宁地区的汉族CHD患者及220名健康者血液。本次研究通过青海大学医学院伦理审查委员会审查，并与所有研究对象签署知情同意书。

1.2 样本收集与DNA提取

抽取受试者外周静脉血5 mL于EDTA抗凝管中，并用Gentra Puregene Blood Kit血液基因组提取试剂盒(Qiagen，158389，德国)提取基因组DNA。用DU800核酸检测仪测定DNA浓度，最终将样品基因组DNA稀释至200 ng/μL后置-20 ℃冰箱保存。

1.3 外显子PCR和测序

通过Primer3.0(version0.4.0)软件为TBX5(NG_007373.1)8个外显子设计引物(表1)。利用2×TaqPlusPCR(Mastermix，天根，北京)分别扩增8个外显子序列。PCR总的反应体系：2×TaqPlus为12.5 μL，上游和下游引物各为1 μL，DNA为1 μL，最后加dd水补足至25 μL。PCR的反应过程：94 ℃预变性300秒，94 ℃变性45秒，60 ℃退火45秒，72 ℃延伸45秒，72 ℃终延伸300秒，共计34个循环。所有样本基因组DNA经1.5%～2.0%琼脂糖凝胶电泳40 min，将所有PCR产物经电泳凝胶成像检验合格后，统一送至上海美吉生物公司，并用ABI3730基因测序仪对所有PCR产物的反应原液进行双向测序。结果返回后与NCBI网站提供的TBX5外显子参考序列进行比对分析。

表1TBX5外显子引物

1.4 统计学分析

利用Excel2013软件对样本群体的代表性进行哈迪-温伯格遗传平衡检验(HWE)。

2.结果

2.1 哈迪-温伯格遗传平衡检验结果

研究组的rs201071418、rs780584178、rs200073406和rs149474574的SNP位点符合哈迪-温伯格遗传平衡定律(χ2=0.001，P=0.973)。

2.2 8个外显子部分PCR产物电泳结果

所有外显子PCR产物电泳条带清晰，各片断反应产物的长度大小与所设计的各片断大小预期值符合，特异性良好(图1)。

外显子1PCR产物电泳图 外显子2PCR产物电泳图

外显子3PCR产物电泳图 外显子4PCR产物电泳图

外显子5PCR产物电泳图 外显子6PCR产物电泳图

外显子7PCR产物电泳图 外显子8PCR产物电泳图

2.3 突变位点测序峰图

对TBX5全部外显子进行测序分析发现，研究组中1号外显子的第93位密码子碱基(rs780584178)发生了同义替换(图2)。7号外显子的第791位密码子碱基(rs201071418)发生了非同义替换(由AGG到AAG，p.R264K)(图3)。8号外显子的第1152位密码子碱基(rs200073406)发生了同义替换(图4)。8号外显子的第1296位密码子碱基(rs149474574)发生了同义替换(图5)。除此之外没有发现其他突变位点。

图2 TBX5外显子1测序峰图(rs780584178)

图3 TBX5外显子7测序峰图(rs201071418)

图4 TBX5外显子8测序峰图(rs200073406)

图5 TBX5外显子8测序峰图(rs149474574)

3.讨论

本研究发现了4例突变，其在NCBI的GeneBank数据库中注册的RS号分别为rs780584178、rs201071418、rs200073406和rs149474574。本次发现的4个SNP位点均未见其与CHD关系的相关报道。研究发现，至少有2%的CHD是由单基因异常引起的[4]。TBX5是心脏早期发育中最重要的转录因子之一[5]。TBX5属于T-box转录因子家族，位于染色体12q24上，研究证实TBX5是HOS的遗传易感基因，与遗传性HOS的发生发展密切相关[6]。此外，TBX5突变不仅导致HOS，还导致心脏畸形。研究发现，TBX5的突变将导致TBX5转录因子的异常表达，TBX5转录因子的过度表达或表达缺陷将导致心脏发育畸形[7]。在人类心脏的发育早期过程中，TBX5主要作为转录因子促进和维持心肌细胞成熟，心脏发育的后期还参与心脏传导系统的形成[8]。而动物实验研究发现，TBX5在鼠、鸡和青蛙中的心脏表达模式与人类非常相似[9]。Diego等[10]对大鼠心脏发育的研究发现，TBX5表达不足会造成大鼠房室间隔缺损。因此，全面把握TBX5在心脏发育中的作用对于理解人类心脏形态结构和功能具有重要意义。

基因多态性与疾病的相关性研究是当前的研究热点，谭等[11]的研究显示，TBX5的rs1895585、rs78441425、rs55646156位点可能与厦门地区单纯性CHD的发生有关；黄等[12]的研究显示，TBX5的rs883079与广西壮族和汉族儿童CHD的遗传易感性有关。刘等[13]的研究显示，rs883079与山东地区单纯性CHD患儿中携带突变纯合基因型A/A的个体有关(风险增加)；Liu等[14]对北京地区192例汉族儿童CHD的研究显示，SNP rs11067075与CHD的发生密切相关；Wang等[15]研究显示，基于动物模型的实验证据证实了心脏发育对TBX5剂量高度敏感，功能变异体TBX5c.1101C>T(rs6489956)可显著增加中国汉族CHD患病的风险。而在国外报道中，Behiry等[16]对埃及150例CHD患者的研究显示，TBX5中的一个变异体(rs6489957)在CHD的发病机制中起着重要作用。因此，充分了解不同地区、不同民族TBX5的结构和功能与CHD发生的关系至关重要。本课题通过对西宁地区的汉族CHD患者TBX5外显子测序研究发现了个别突变位点的存在，可能与CHD有一定的相关性。本次研究只对TBX5外显子区域进行了测序分析，故存在一定的局限性，不能全面说明该基因的突变是否导致CHD的发生。

本课题对人群和种族进行了限定，旨在探讨TBX5外显子区域突变与西宁地区汉族人群CHD的相关性。本研究只在核酸分子水平做了检测，未在蛋白分子水平做进一步研究。本研究结果显示，TBX5 SNP位点rs201071418的突变位点为非同义突变，编码的氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸，可能会引起相关蛋白的表达异常，最终导致CHD的发生。尽管在本次研究中SNP位点rs780584178、rs200073406、rs149474574均为非同义突变，但仍可能影响基因转录水平以及最终蛋白质的表达。由于本研究发现的4个SNP位点的突变均未在对照组中出现，因此未做两组间的等位基因频率以及基因型频率的比较。为了更好地研究高海拔地区乃至高原地区CHD的发生机制，仍需做比较研究。因此本课题下一步将从TBX5非编码区选择SNP位点进行基因分型比较，以明确并验证西宁地区汉族人群TBX5突变与CHD的发病机制。

本研究结果显示，西宁地区汉族人群CHD可能与TBX5突变存在相关性。