王 冰，陈 凡，冯瑞兴，殷 麟，杨 美，孙祥益

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810000；2.青海大学附属医院，青海大学附属肿瘤医院，青海 西宁 810000)

放射肠道损伤严重时会出现肠坏死、肠穿孔，甚至导致患者死亡[1]。目前临床上对放射性肠损伤尚无理想的防治手段[2]。

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)有抗氧化、抗肿瘤以及免疫调节等广泛的生物学功能[3]。有研究认为，LF还具有一定抗辐射损伤的作用[4]，但其对放射性肠损伤是否有影响目前尚无定论，高海拔下为何种情况尚无报道。本研究在建立小鼠放射性肠损伤模型的基础上，探讨LF对高海拔雄性小鼠急性放射性肠损伤的作用。

1.材料与方法

1.1 实验动物选择及饲养

SPF级雄性C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体重(20±2)g，购自西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2017-003。在青海大学基础研究中心实验动物房饲养，环境温度18 ℃～22 ℃，湿度50%～70%。实验期间予小鼠自主饮食(普通小鼠维持饲料，北京科澳协力饲料有限公司)饮水。所有小鼠适应性喂养7 d后进行实验。所有动物实验程序严格遵守有关国家动物实验管理的政策法规和实验动物伦理福利原则。

1.2 主要试剂与仪器选择

牛乳提取乳铁蛋白(批号：146897-68-9，含量95%，上海源叶生物科技有限公司)；小鼠丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、二氨氧化酶(DAO)、一氧化氮(NO)、转化生长因子β(TGF-β)Elisa检测试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司)；23EX医用电子直线加速器(美国Varian医疗系统公司)；台式电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏设备公司)；包埋机(浙江省金华市科迪仪器)；切片机(德国LEICA)；水浴锅(江苏荣华公司)；显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)。

1.3 药物预处理

取LF溶于生理盐水，按比例分别配置浓度为20、40、60 mg/mL的LF溶液，置4 ℃冰箱保存备用。每次用前摇晃均匀，并待其恢复到室温后再行灌胃。

1.4 分组与给药

小鼠适应性喂养第7 d时，观察小鼠有无不良反应，进食饮水活动是否正常。将50只小鼠随机分为正常对照组、单纯照射组、2 mg LF+照射组、4 mg LF+照射组、6 mg LF+照射组(每组10只)。LF各组每天通过灌胃的方式给予相应剂量的药物，正常对照组及单纯照射组以同样方式予0.1 mL生理盐水连续灌胃10 d，于第7 d对各照射组小鼠进行照射。实验期间小鼠自由摄食及饮水。

1.5 放射性肠损伤模型的建立

灌胃第7 d起将小鼠禁食12 h，不禁水，之后用5%水合氯醛行腹腔注射麻醉，将各照射组小鼠固定在特制固定板上，参照文献[5]予以小鼠23 EX医用直线加速器单次腹部14 Gy剂量照射， 剂量率为400 cGy/min，照射范围为剑突至耻骨联合， 照射面积为2.0×2.0 cm，源皮距(SSD)为100 cm。照射完毕待小鼠苏醒后将其放回笼内。

1.6 检测

1.6.1 一般情况：观察小鼠饮食、活动状态，胃肠道症状(粪便性状及频率)以及体重变化。

1.6.2 肠黏膜组织病理形态变化情况：参照文献[5，6]于照射后第3 d行5%水合氯醛腹腔麻醉，处死小鼠后迅速打开腹腔，取2 cm空肠组织，用10%甲醛液固定24 h，行常规包埋、切片、染色，置光镜下观察小肠黏膜及绒毛组织形态学变化情况。

1.6.3 血浆DAO、TGF-β的测定方法：照射后第3 d起禁食12 h后用5%水合氯醛麻醉小鼠，在无菌状态下从眼球取血，加入肝素抗凝，离心(4℃，2500r/min)10 min，取上层血浆置-80 ℃冰箱保存。按照Elisa试剂盒说明书测定血浆DAO、TGF-β的含量。

1.6.4 小肠组织匀浆MDA、SOD、NO的测定方法：取小鼠空肠组织2 cm，将肠组织放入液氮后研磨，加入Ripa裂解液裂解，离心(4℃，4000r/min)4 min(r=7cm)，取上清液置4 ℃冰箱保存，分别按照MDA、SOD及NO Elisa试剂盒说明书测定MDA、SOD及NO含量。

1.7 统计学处理

2.结果

2.1 小鼠一般情况

照射后24 h各组均未见明显异常，较照前无明显改变。照射后48 h单纯照射组小鼠均出现稀水样便，无黏液样便和血便，精神较之前萎靡，行动稍迟缓，饮食差；2 mg LF+照射组1只小鼠出现稀水样便，精神尚可，饮食正常。照射后72 h单纯照射组有4只小鼠有黏液样便，无血便；2 mg LF+照射组有3只小鼠出现稀水样便，无黏液样便和血便，精神稍萎靡，饮食欠佳，其他小鼠无明显胃肠道症状，未见死亡。与正常对照组比，单纯照射组小鼠体重明显减轻(P<0.01)；与单纯照射组比，LF各组体重差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 各组小鼠照射后第3天体重

2.2 病理组织学改变情况

HE染色显示，正常对照组小鼠小肠黏膜组织上皮细胞结构正常、排列整齐，无肿胀、坏死、肠黏膜断裂等情况，隐窝排列整齐。而单纯照射组与正常对照组比，部分肠绒毛断裂脱落，肠上皮结构部分消失、隐窝排列紊乱(部分丢失)，腺体腔内可见炎性细胞浸润。2 mg LF+照射组与单纯照射组比，肠绒毛断裂脱落情况稍有好转，但隐窝排列紊乱。4 mg LF+照射组与单纯照射组比，肠绒毛和隐窝排列逐渐好转。6 mg LF+照射组与单纯照射组比，肠绒毛结构基本恢复正常、隐窝排列整齐(图1)。

正常对照组 单纯照射组

2mg LF+照射组 4mg LF+照射组 6mg LF+照射组

2.3 血清DAO、TGF-β水平

与正常对照组比，单纯照射组小鼠血清DAO、TGF-β水平明显升高(P<0.05)。与单纯照射组比，各LF组小鼠血清DAO水平均降低(P<0.05)；4 mg LF+照射组和6 mg LF+照射组血清TGF-β水平降低(P<0.05)。与单纯照射组比，2 mg LF+照射组血清TGF-β水平差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 各组小鼠血清中DAO、TGF-β水平

2.4 小鼠小肠MDA、SOD、NO含量

与正常对照组比，单纯照射组小鼠小肠组织匀浆MDA、SOD、NO水平均有明显改变，其中MDA、NO水平明显升高(P<0.05)，SOD活性下降(P<0.05)。与单纯照射组相比，4 mg LF+照射组和6 mg LF+照射组的MDA、NO水平下降(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)。与单纯照射组小鼠比，2 mg LF+照射组小鼠小肠组织MDA、NO、SOD水平变化不明显(P>0.05，表3)。

表3 各组小鼠小肠组织匀浆中MDA、SOD和NO水平

3.讨论

急性放射性肠损伤发生在放疗初期，是由增殖迅速的小肠隐窝上皮细胞的死亡和小肠固有层细胞持续性的急性炎症反应所致[1，7]。为避免正常组织发生放射损伤，可通过干扰辐射伤害机制，调节辐射下游发生的病理生理过程，提高放射线耐受性，避免正常组织损伤、增强修复能力，来预防、阻止放射性肠损伤的发生、发展[1]。然而放射性肠损伤尚无特异有效的防治措施[2]。因此，探讨放射性肠损伤可能存在的机制，积极地对放射性肠损伤进行预防和治疗具有重要的临床意义。

LF具有广泛的生理与药理作用。Anne Blais[8]等研究发现，LF在体外促进小肠上皮细胞的增殖。Feng L[4]等研究发现，LF可增加小鼠的PLT和白细胞计数并减少DNA损伤，具有一定的抗辐射损伤作用。LF还可作为转录因子参与基因的转录调控，与DNA序列高效特异结合，进而调节TGF-β的表达[9]。LF具有阻断人癌细胞周期、下调细胞周期蛋白E1水平、诱导S期延长[10]；诱导癌细胞凋亡[11]；抑制癌细胞迁移、侵袭和转移[12，13]等抗癌作用。并且增加NK细胞介导的细胞毒性，发挥免疫调节作用[11，14，15]。Marian L.Kruzel[16]等研究发现，LF可抑制与超氧化物分子的自由铁(Fe3+)离子反应性，控制活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生及其消除速率的生理平衡，通过限制羟基自由基的产生和脂质过氧化，缓冲了氧化性细胞损伤。但是LF对放射性肠损伤的防治作用及其机制尚不明确，有待进一步研究确认。

本研究在成功建立小鼠放射性肠损伤的基础上，探讨LF对小鼠肠道放射损伤的保护作用。结果显示，照射后小鼠出现稀水样便等胃肠道反应，单纯照射组小鼠体重明显降低，小肠组织病理出现小肠绒毛断裂脱落、正常结构消失，小肠隐窝细胞增殖受限，凋亡上调，肠隐窝排列紊乱，腺体腔被炎性细胞浸润，达到放射性肠损伤病理标准[6]。而LF减轻了小鼠的小肠黏膜病理损伤(小肠绒毛断裂脱落减少，隐窝排列逐渐整齐)。血浆DAO是存在于肠绒毛上皮细胞胞质内具有高度活性的细胞质酶，射线照射破坏肠绒毛细胞结构致胞质内DAO释放入血。因此，DAO可作为早期肠黏膜损伤和恢复变化的较敏感指标[17]。受照射后，小鼠血浆DAO明显升高，说明照射致小鼠小肠绒毛细胞结构破坏，发生早期的小肠黏膜损伤。各LF组小鼠DAO含量较单纯照射组少，表示LF可以一定程度恢复肠绒毛细胞结构，缓解小肠黏膜损伤。王亿龙[18]等对小鼠放射性肠损伤的研究中发现，射线照射诱导NO合酶活性增高，产生大量的NO，抑制腺苷酸环化酶的活性和环磷腺苷的合成，造成肠上皮细胞的损伤，NO水平可作为放射性肠损伤程度的指标。照射后小鼠小肠组织匀浆NO水平明显增高，导致小鼠放射性肠损伤，4 mg、6 mg LF+照射组小鼠小肠组织匀浆NO水平较单纯照射组低，表示LF可以降低放射性肠损伤的严重程度起到保护作用。与ROS对应的还原系统中的SOD的活性反映辐射对肠道氧化应激的影响[19]。由于细胞膜中不饱和脂肪酸的氧化，ROS的形成会导致MDA分泌，MDA作为脂质过氧化产物，其含量可间接反映小肠组织辐射后损伤程度[20，21]。本实验单纯照射组小鼠受照射后小肠组织SOD活性明显下降，MDA含量升高，肠道氧化应激反应明显增强，LF干预小鼠恢复SOD活性，并且使MDA含量降低，推测LF可以通过缓解小鼠肠道氧化应激反应降低放射性肠损伤程度。在动物实验中，辐射导致TGF-β免疫反应性持续增强。TGF-β作为有效的纤维化和促炎性细胞因子，在肠壁免疫调节系统中起重要作用，抑制TGF-β1信号传导可降低放射性肠病的临床反应[22]，TGF-β1还可增加线粒体ROS的产生，从而影响肠道氧化应激水平[19，23，24]。照射后小鼠血清TGF-β水平升高明显，免疫反应增强，氧化应激水平升高，而4 mg、6 mg LF组小鼠的TGF-β水平较单纯照射组小鼠低，说明LF可以降低炎症因子的分泌水平，减轻肠道氧化应激反应。另外，本实验全程在平均海拔2 000米以上的青海地区完成，高原地区低氧环境使体内缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor，HIF)水平上调[25]，体内HIF水平的上调，会刺激肠道树突状细胞发挥免疫作用[26]和减轻肠道上皮细胞及肠道隐窝干细胞损伤，一定程度起到使肠道组织免受辐射损伤的作用[27]，其效果与LF可能存在协同作用。低氧的环境也会导致血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表达增强[28]，VEGF上调保护肠道微血管内皮，减轻肠道损伤[27]。以上因素可能会对实验结果造成影响。

综上所述，表明LF对放射性肠损伤具有一定的防治作用，其作用机制可能与减轻肠道氧化应激反应，减少炎症因子分泌和减弱炎症反应有关。