史默怡 韩宇博 刘莉

益气温阳活血利水方为笔者团队治疗慢性心衰的经验用方，此方法在改善患者中医症候、心脏功能、临床症状方面具有很好疗效[1]。前期研究已经证明此方可以改善去甲肾上腺素致H9c2心肌细胞损伤和阿霉素致大鼠心衰模型心肌能量代谢[2-3]，为进一步探究机理，在前期基础上，本课题选用大鼠H9c2心肌细胞为实验对象，观察益气温阳活血利水方含药血清对AngII诱导心肌细胞凋亡以及对线粒体凋亡途径相关基因及蛋白的表达影响，为该药的临床应用提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及动物

H9c2大鼠心肌细胞来源于上海中科院细胞库；雄性SD大鼠45只，体重(200±20)g，购买于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(黑)2015006，普通饲料喂养，适应环境2周后进入实验状态。

1.2 实验药物

益气温阳活血利水方：白人参20 g、黄芪20 g、桂枝10 g、丹参15 g、白术15 g、茯苓20 g、葶苈子15 g、益母草15 g、淫羊藿20 g、仙鹤草30 g、甘草10 g，购买于黑龙江中医药大学附属第一医院中药局。

1.3 主要仪器

倒置荧光显微镜(上海麦尚科学仪器有限公司)；酶标仪(上海申胜生物技术有限公司)；高速低温离心机(德国Sartorius公司)；-80℃超低温冰箱(中国海尔)；96孔板(美国Bio-Rad公司)。卡托普利干粉(1 g)(SIGMA，产地美国，分子量：217)。

1.4 主要试剂

Real-time PCR试剂盒(上海 Novland Co.Ltd )；血管紧张素II干粉(5 mg，SIGMA，产地美国，分子量：1046)1 mg溶解于10 mL PBS制成浓度为1×10-4mol/L的储存液，使用时1：100稀释，造模浓度为1×10-6mol/L，微孔滤膜滤过，分装，避光-20℃保存。卡托普利干粉(1 g，SIGMA，产地美国，分子量：217)0.217 mg溶于10 mL PBS溶液，使用时1：10稀释，有效浓度为1×10-5mol/L，微孔滤膜滤过，分装，避光-20℃保存。

1.5 中药汤剂制备

方剂中所有中药在蒸馏水浸泡2小时，操作时白人参切片，葶苈子包煎，煎煮2次，每次煮沸后再煎煮30分钟，纱布滤过，两次药液合并，水浴浓缩成每毫升含6 g生药的药液。

1.6 含药血清制备

45只SD大鼠用随机数字方法分为空白对照组15只，中药方组30只，灌胃前禁食12小时，空白对照组每日灌服与中药方组等体积生理盐水，中药方组每日灌服34.2 g生药(5.7 mL/200 g大鼠，剂量按70 kg人与200 g大鼠体表面积等效剂量的10倍灌胃)，每日2次，连续给药3天，于末次灌胃1～2小时内无菌条件下眼动脉采血，3000 r/min离心15分钟分离血清，0.22 μm微孔滤膜过滤，56℃灭活30分钟，分装标示后-80℃保存备用。

1.7 细胞培养

H9c2细胞置于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中培养，将接种好的培养瓶瓶口旋松置于37℃、5%CO2培养箱中，根据情况每1～2天更换培养液，当细胞镜下观察约至瓶底80%以上时传代。传代时用PBS清洗加入1 mL 0.25%胰酶消化细胞，培养瓶长轴轻轻摇晃使之覆盖全细胞表面，约1分钟时间，当肉眼观察瓶体内液体出现流沙样改变或显微镜下发现细胞变圆、细胞间隙变大、细胞脱落瓶底时立即加入1 mL完全培养液，终止消化，用吸管吹打，使细胞从瓶壁脱落，并且形成细胞悬液，1000 r/min离心5分钟，弃上清。用1 mL培养液将细胞混匀，细胞计数。

1.8 细胞分组及给药方法

实验分为6组。含药血清预处理4小时后加入AngII，使最终AngII浓度为1×10-6mol/L，继续培养72小时诱导细胞凋亡模型。空白血清对照组：DMEM+8%空白血清；模型组：DMEM+8%空白血清+ AngⅡ；含药血清高剂量组：DMEM+8%含药血清+AngⅡ；含药血清中剂量组：DMEM+4%含药血清+4%空白血清+AngⅡ；含药血清低剂量组：DMEM+2%含药血清+2%空白血清+AngⅡ；卡托普利组：DMEM+8%空白血清+卡托普利(1×10-5mol/L)+ AngⅡ。

1.9 MTT法检测H9c2心肌细胞增殖活性

收集处于对数生长期细胞状态良好的H9c2心肌细胞，胰酶消化，离心，重悬，细胞计数，用DMEM完全培养基调整细胞数量，以每孔5×103个细胞数目接种于96板孔中，每孔培养基液体为100 μL，置于培养箱中，细胞生长至平底约80%时，弃去液体，加入不含血清DMEM培养液继续培养12小时，使细胞处于饥饿。含药血清干预，细胞分为6组，每组5个复孔，药物提前预处理4小时后加入AngII，使最终AngII浓度为1×10-6mol/L，继续培养72小时后每实验孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，孵育4小时。弃去培养液，加入150 μL DMSO，避光，振荡摇匀10分钟，使结晶物充分融解。选择490 nm波长，在酶联免疫仪器上测OD(opticol density，OD)值，每组重复3次，记录结果，计算细胞增殖率，增殖率(%)=实验组OD值/正常组OD值×100%。

1.10 罗丹明123测H9c2心肌细胞线粒体膜电位

离心后的细胞重悬于培养基中，加入Rho123荧光染液0.5 μg/mL，放置在细胞培养箱中孵育10分钟，PBS洗涤细胞2次，重新重悬细胞于培养基中，培养60分钟。取100 μL细胞混合液涂于载玻片上，荧光显微镜观察，激发滤光片波长488 nm，阻断滤光片波长515 nm，荧光显微镜观察，拍照。

1.11 免疫组化检测H9c2细胞Bcl-2、Bax的表达

细胞造模，细胞爬片采用10%福尔马林固定20分钟，PBS冲洗2次，每次2分钟；SABC染色法进行细胞染色，每组细胞爬片滴加3%H202，室温下10分钟，PBS洗涤3次。滴加5%BSA封闭液，室温下孵育30分钟。滴加一抗4℃下过夜，滴加二抗，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3次，每次2分钟，甩干，DAB溶液显色，镜下观察，苏木素复染，冲洗，酒精梯度干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。Motic 3000显微摄影系统摄片，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析，积分光密度(IOD)=阳性面积×平均光密度，在400倍视野拍摄分析，每组每次实验随机3次。

1.12 qRT-PCR法检测H9c2细胞Caspase-9 mRNA表达

细胞培养同前，细胞收集后，使用RNA提取试剂盒提取细胞RNA，检测RNA的浓度和产量以及RNA的完整性。按 “Reverse Transcription Reaction System”试剂盒说明书完成逆转录反应合成cDNA，将设计的引物序列与cDNA结合做RT-PCR，反应条件：Real-time PCR循环参数设定：95℃ 3分钟，95℃ 30秒，62℃ 40秒，共40个循环。见表1。

表1 基因引物序列

1.13 Western Blot法检测H9c2细胞Caspase-9蛋白表达

收集H9c2心肌细胞，提取总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，配胶完成SDS-PAGE蛋白质电泳，浓缩胶80 V，30分钟，待溴酚蓝指示剂移至凝胶底部时调到100 V，电泳结束后，PVDF膜转膜，膜侧为正极，胶侧为负极，250 mA，2小时，取膜，丽春红染液进行染色，脱脂牛奶封闭液，过夜，一抗、二抗孵育，显影、定影。

1.14 统计学处理

2 结果

2.1 MTT法检测H9c2心肌细胞增殖活性

为了研究益气温阳活血利水方含药血清对AngII诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响，从前期实验中选取3个含药血清浓度(8%、4%、2%)，并以卡托普利组作为阳性对照组，AngII造模时间为72小时，测OD值，并算出各实验组细胞增值率。结果显示：模型组与空白组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，增值率明显降低。含药血清高、中、低组OD值、增值率与模型组比较具有统计学意义(P<0.05)，并且随浓度的升高其增值率增高，具有剂量依赖性，含药血清高剂量组增值率最高。含药血清高剂量组与阳性对照组OD值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，含药血清高剂量组增值率略低于卡托普利对照组。如表2。

2.2 Rho123观察H9c2心肌细胞线粒体膜电位

如图1所示：空白含药血清组细胞荧光最强，呈明亮的荧光绿色；模型组细胞荧光强度明显减弱，呈暗色调的荧光绿色。通过益气温阳活血利水方含药血清预处理后线粒体膜电位明显改善，高剂量组荧光与模型组比较荧光强度明显增强，中剂量组较高剂量组差之，低剂量组仅稍有改善。卡托普利组与含药血清高剂量组无明显差别。

表2 益气温阳活血利水方含药血清对AngII诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响

注：与空白对照组比较aP<0.05，与模型组比较bP<0.05，与卡托普利组比较cP<0.05。

2.3 免疫组化检测H9c2细胞Bcl-2、Bax的表达

免疫组化结果示如图2示：空白对照组Bcl-2、Bax蛋白未见明显表达，呈弱阳性显色。与空白对照组比较，AngII模型组Bcl-2蛋白表达减弱(P<0.05)，Bax蛋白表达显著增强(P<0.05)。与模型组比较，含药血清组可见Bcl-2蛋白表达增高(P<0.05)，Bax蛋白表达下降(P<0.05)，呈正相关剂量依赖性趋势，以高剂量组调节作用最为明显。与阳性对照组比较，含药血清高剂量组上调Bcl-2效果优于卡托普利(P<0.05)，下调Bax效果逊于卡托普利(P<0.05)。见表3。

表3 益气温阳活血利水方含药血清对AngII诱导H9c2细胞Bcl-2、Bax免疫活性的影响

注：与空白对照组比较aP<0.05，与模型组比较bP<0.05，与卡托普利组比较cP<0.05。

2.4 Real Time-PCR法检测H9c2细胞Caspase-9的mRNA表达

正常情况Caspase-9的mRNA以一定量低表达，AngII处理72小时后表达含量明显升高，含药血清预处理组可以拮抗AngII导致两者的升高表达，以含药血清高剂量组拮抗效果最好。卡托普利组下调作用优于含药血清高剂量组。见表4。

注：A 空白对照组；B 模型组；C 含药血清高剂量组；D 含药血清中剂量组；E 含药血清低剂量组；F 卡托普利组

图1 益气温阳活血利水方含药血清作用后H9c2心肌细胞内Rho123荧光强度变化(72小时，×400)

注：A 空白对照组；B 模型组；C 含药血清高剂量组；D 含药血清中剂量组；E 含药血清低剂量组；F 卡托普利组

图2 益气温阳活血利水方含药血清对AngII诱导H9c2细胞Bcl-2、Bax免疫活性的影响(72小时，×400)

表4 益气温阳活血利水方含药血清对H9c2心肌细胞Caspase-9mRNA相对表达含量

注：与空白对照组比较aP<0.05，与模型组比较bP<0.05，与卡托普利组比较cP<0.05。

2.5 Western Blot法检测H9c2细胞Caspase-9蛋白的表达

AngII能够促进H9c2心肌细胞的Caspase-9蛋白的表达，蛋白相对表达量与空白对照组比较具有统计学意义(P<0.05)，不同浓度的益气温阳活血利水方含药血清预处理后，可降低Caspase-9蛋白的表达含量，具有剂量依赖性，各含药血清组蛋白相对表达量与AngII模型组比较具有统计学意义(P<0.05)，卡托普利组结果优于含药血清高剂量组，两者比较无统计学意义(P>0.05)。见表5和图3。

表5 益气温阳活血利水方含药血清对H9c2心肌细胞Caspase-9蛋白表达的影响

注：与空白对照组比较aP<0.05，与模型组比较bP<0.05，与卡托普利组比较cP<0.05。

注：1空白对照组；2模型组；3含药血清高剂量组；4含药血清中剂量组；5含药血清低剂量组；6卡托普利组。

图3 益气温阳活血利水方含药血清对H9c2心肌细胞Caspase-9蛋白表达影响印迹图

3 讨论

在心血管疾病终末期阶段，细胞凋亡是重要病理机制。细胞凋亡使心肌细胞数量绝对值减少，最终导致心肌收缩功能降低[4]。神经体液过度激活参与到了细胞凋亡的病理机制。Chen BC等[5]研究也证实AngII引起大鼠心肌细胞凋亡的发生。线粒体凋亡途径是参与凋亡的重要机制，Bcl-2、Bax、Caspase-9是重要的分子机制。Bcl-2和Bax的表达含量决定细胞的命运，Bax表达占优势时，形成Bax同源二聚体，促进细胞凋亡；而Bcl-2表达占优势时，Bcl-2与Bax形成异源二聚体，抑制细胞凋亡，通过两者间的平衡调控细胞存亡[6]。定位在外膜的Bcl-2形成阳离子通道，使质子能从线粒体转运到胞浆，避免膜间隙酸化而抑制Cyt-C的释放，抑制凋亡；Bax通过与阴离子通道或直接使基质肿胀而诱发线粒体膜电位的改变，促进Cyt-C释放而促进凋亡。Bcl-2家族亦可与Caspase直接结合调控细胞凋亡过程，形成Bcl-2-Apaf-1-Caspase复合物，抑制Caspase-9、Caspase-3的激活，但这种方式不影响Cyt-c和Apaf-1对Caspase-9的激活[7-8]。综上，本课题选择Bcl-2、Bax及Caspase-9线粒体凋亡过程的关键指标，来反应益气温阳活血利水方含药血清对线粒体凋亡途径的影响。

益气温阳活血利水方全方补而不助邪，泻而不伤正，用药精当，组方严谨，调补阴阳，温补脏腑，重在温补心肾，药物组合即入“气分”，也入“血分”。方中人参、黄芪为君药，人参为群草之冠，大补元气、滋补强壮；黄芪能够固表驱邪，实腠理、强卫气，且有利水之功。桂枝温通心阳，化气助阳，平冲降逆；丹参活血化瘀，茯苓、白术健脾利湿，固中州助运化，共为臣药。益母草活血化瘀利水；葶苈子泻肺平喘利水，且与黄芪配伍，一升一降；仙鹤草补虚消积；淫羊藿温肾助阳共为佐药。甘草调和诸药。以上诸药共奏益气温阳、活血利水之功效。现代药理研究发现人参的主要有效成分人参皂苷，具有调节神经内分泌功能，促进下丘脑分泌促肾上腺皮质激素，提高机体应激能力，同时可增加心肌细胞内cAMP含量，增强心肌细胞收缩力[9-10]；黄芪有利尿、抗衰老、增强应激和机体免疫力、抗菌的作用，同时扩张冠状动脉，抑制心肌细胞凋亡[11-12]。桂枝能扩血管，改善血液循环，抗凝、抗纤维蛋白酶，且同时具有利尿作用。关于作用，《本草纲目》记载黄芪配桂枝：“黄芪补三焦，实卫气，与桂同功，特比桂甘平，不辛热为异耳，但桂则通血脉，能破血而实力气，芪则益气也。”

本实验研究通过前期预实验总结，选用1×10-6mol/L AngII 72小时成功诱导细胞凋亡模型，AngII作用H9c2心肌细胞72小时后，MTT结果示，与正常对照组相比，AngII可显著降低心肌细胞活性，益气温阳活血利水方含药血清可以显著拮抗AngII致使的细胞损伤，且这种拮抗作用具有正相关剂量依赖性，其中以含药血清高剂量组(8%)效果最为显著。本研究用qRT-PCR、Western Blot及免疫组化实验方法检测了线粒体凋亡途径相关Bcl-2、Bax及Caspase-9的表达水平，结果示与空白对照组相比，模型组AngII损伤细胞后，Caspase-9的表达水平升高，Bcl-2/Bax的比例降低，AngII通过调节上述线粒体凋亡途径相关基因及蛋白的表达而促使H9c2心肌细胞凋亡，本研究结果与Raul Vivar课题组用AngII诱导新生幼鼠原代培养心肌细胞凋亡以及线粒体凋亡相关基因及蛋白表达的改变结果一致[13]。益气温阳活血利水方含药血清能显著降低AngII诱导心肌细胞的凋亡水平，降低了AngII造模后升高的Caspase-9基因及蛋白和Bcl-2/Bax蛋白的表达水平，而且这种调节方式具有正相关剂量依赖性，以含药血清高剂量组的调节方式和改善细胞的凋亡情况最好，最终有力证明益气温阳活血利水方含药血清通过调节了线粒体凋亡途径抑制了细胞凋亡。

综上所述，笔者推断益气温阳活血利水方含药血清通过调节线粒体凋亡途径Bcl-2、Bax蛋白的表达水平而抑制线粒体膜电位下降，抑制细胞色素C的释放和Caspase-9的表达从而抑制细胞凋亡。