王 琳，赵 格，赵建梅，高玉斌，颜世敢，李月华，刘 娜，张青青，黄秀梅，刘俊辉，王君玮

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南 250353）

旋毛虫病是由人和动物食入生的或未完全加工熟制的寄生有旋毛虫（Trichinella spiralis）的肉类而引起的一种人兽共患病。饮食习惯是造成人感染旋毛虫的主要风险因素[1-3]。1964—2009 年我国有记录的旋毛虫病暴发流行已达850 余起，其中猪肉是人旋毛虫病的主要风险来源[4]。因此，旋毛虫一直是我国屠宰检疫中肉类的首检和必检病原[5]。刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）也是一种能引发人兽共患病的食源性寄生虫。据文献[6-8]报道，我国部分区域猪弓形虫感染率在5.34%～75.95%之间，地区差异性较大，严重危害公共卫生和养殖业安全。我国是猪肉消费大国，检测屠宰环节猪肉中的旋毛虫和弓形虫，对猪肉食品安全至关重要。

近年来，以PCR 为基础的分子生物学检测方法和以ELISA 为例的血清学检测方法，在检测猪旋毛虫和弓形虫方面具有稳定的敏感性和特异性[8-12]。本研究结合本实验室近几年生猪旋毛虫和弓形虫检测数据，选取广东、山东、云南3 省，采集猪膈肌和猪血清样品，利用分子生物学方法和血清学方法，对部分屠宰场屠宰环节猪旋毛虫和弓形虫的感染情况进行检测，以期为我国生猪屠宰环节寄生虫监测管理以及猪肉食品安全提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品

1.1.1 猪膈肌 从广东、山东、云南3 省15 个大型（日屠宰量＞1 000 头）和中小型（日屠宰量＜1 000头）猪屠宰场（广东5个、山东4个、云南6个），随机采取外观健康猪膈肌315 份，每份100 g，-20 ℃存储备用，其中广东114份、山东81份、云南120份。

1.1.2 猪血清 从广东、山东、云南3 省15 个大型（日屠宰量＞1 000 头）、中小型（日屠宰量＜1 000 头）屠宰场（每省份5 个），随机采取外观健康猪血清254 份，每份血清样品3 mL，-20 ℃存储备用。

1.2 主要试剂

PCR 方法所用的血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）（货号DP304），购于天根生化科技（北京）有限公司；Master Mix，购于美国Promega 公司；琼脂糖，购于西班牙Biowest 公司；Marker-1000，购于宝生物工程（大连）有限公司。

ELISA 方法所用的猪用旋毛虫抗体检测试剂盒（货号212321）和猪用弓形虫抗体检测试剂盒（货号212221），均购于深圳市康百得生物科技有限公司。

1.3 样品制备及组织DNA 提取

使用无菌剪刀，随机剪取5 处猪膈肌组织置于无菌离心管中，加入无菌钢珠和适量PBS 缓冲液，于全自动样品快速研磨仪（Tissuelyser-48）中研磨充分，参照天根基因组DNA 提取试剂盒说明书提取DNA。提取的DNA 于-20 ℃保存。

1.4 引物合成

参照文献[13-14]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成旋毛虫和弓形虫引物。旋毛虫PCR 扩增上游引物为：5'-GTTCCATGTGAACAGCAGT-3'，下游引物为5'-CGAAAACATACGACAACTGC-3'。弓形虫第1 轮PCR 扩增上游引物为：5'-TGCGGAAGGATCATTCACG-3'，下游引物为5'-CCGTTACTAAGGGAATCATAGTT-3'；第2 轮PCR 扩增上游引物为：5'-GATTTGCAT TCAAGAAGCTGATAGTAT-3'，下游引物为5'-AGTTAGGAAGCAATCTGAAAGCACATC-3'。

1.5 PCR 扩增

以ESV序列为旋毛虫目的基因[13]进行PCR扩增；以333 bp 的ITS1序列为弓形虫目的基因[14]进行巢式PCR 扩增。反应体系为：2×PCR Mixture 10 μL，20 μmol/L 上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，样品DNA 1 μL。反应条件参照文献[13-14]，扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.6 ELISA 检测

猪弓形虫和旋毛虫的ELISA 检测参照试剂盒说明书进行，试验结果用酶标仪于450 nm 波长读取OD 值。

2 结果与分析

2.1 不同地区检测情况

2.1.1 PCR 检测 对3 个省份采集的315 份屠宰生猪膈肌样品进行旋毛虫和弓形虫PCR 检测，结果所有样品均为旋毛虫阴性（图1），仅在云南省120 份样品中检出的1 份弓形虫阳性（图2），检出率为0.83%，表明广东、山东、云南3 省屠宰生猪猪旋毛虫和弓形虫携带率极低。

图1 猪膈肌样品旋毛虫PCR 鉴定结果

图2 猪膈肌样品弓形虫PCR 鉴定结果

2.1.2 ELISA 检测 利用ELISA 方法，对屠宰生猪血清样品进行旋毛虫和弓形虫抗体检测，发现旋毛虫和弓形虫血清抗体阳性率分别为1.97%和2.36%（表1），提示这些屠宰猪群在饲养环节可能感染过旋毛虫和弓形虫。不同地区阳性率存在一定差异：就旋毛虫而言，山东省检测阳性率较高（4.82%），而云南省未检出；就弓形虫而言，广东省检测阳性率较高（4.21%），而山东省未检出。这表明猪旋毛虫和弓形虫在不同地区的分布并不一致。

表1 猪血清样品寄生虫ELISA 抗体检测情况

2.2 不同规模屠宰场检测情况

对不同规模屠宰场来源的血清样品进行寄生虫抗体检测，发现中小型屠宰场屠宰生猪的阳性率均高于大型屠宰场（图3）。其中：中小型屠宰场旋毛虫检测阳性率为2.67%（4/145），大型屠宰场为0.92%（1/109）；中小型屠宰场弓形虫检测阳性率为2.76%（4/145），大型屠宰场为1.83%（2/109）。这表明中小型屠宰场屠宰猪群在饲养环节感染寄生虫的风险较高。

3 讨论

图3 不同规模屠宰场生猪寄生虫感染情况对比

旋毛虫病曾在家猪中广泛传播，现在许多国家通过禁止给猪饲喂生泔水和开展肉类检测等措施来控制旋毛虫病。随着生猪饲养管理不断趋于严格和规范，饲养条件得到大大改善，生猪的旋毛虫和弓形虫感染率已经大大降低。采样时调研发现，各屠宰场均通过压片镜检法对旋毛虫进行检测，检出率均为0，但未对弓形虫进行规模化检测。镜检法检测成本低，但敏感性和特异性低，对操作人员要求高，容易出现误诊和漏诊[15-16]。由于猪感染寄生虫前期临床症状不明显，但有寄生虫感染史的猪只可在血清中产生抗体，因此ELISA 法受采样方法影响小，敏感性高，为目前国内外较常用的检测方法。但该方法不能检测猪肉中是否携带寄生虫，且受特异性低的影响存在一定的假阳性[12]。PCR 法能够直接检测出猪肉中的寄生虫，特异性高，但仅在检测样品中含有病原体时才能检出阳性，其敏感性受采样方法、样品提取DNA 质量及效率的影响较大[10]。本研究应用PCR 和ELISA 两种方法，对旋毛虫和弓形虫同时进行病原学和免疫学检测，敏感性和特异性相对稳定[8-12]。两种方法同时检测，可大大减少旋毛虫和弓形虫对消费者造成的风险。

本实验室连读5 年对我国旋毛虫和弓形虫高发地区屠宰生猪血清样品进行检测，发现感染率总体呈下降趋势，并且2019 年抗体阳性率达到历年最低，其中旋毛虫抗体阳性率由2016 年的10.36%降至2019 年的1.97%，弓形虫抗体阳性率由2015年的17.21%降至2019 年的2.36%。究其原因，可能是因为我国生猪养殖不断趋于规模化、规范化和科学化，与啮齿动物和猫的接触基本杜绝，饲料、饮水及养殖环境日益优化；且因非洲猪瘟暴发，各生猪养殖场更是加大了清洗消毒频次和强度，从而更加净化了养殖环境。本研究检测发现，不同地区生猪寄生虫感染率不同，这可能与不同地区生猪养殖场环境、养殖方式和养殖模式有关，也可能与屠宰场生猪来源有关。本研究从山东、广东、云南3省屠宰场采集的样品也可能来自其他省份，结果的真实性存在偏倚。研究还发现，中小型屠宰场屠宰生猪旋毛虫和弓形虫感染率高于大型屠宰场，这可能是因为中小型屠宰场的猪只来源较复杂，饲养条件和规范化程度参差不齐，而大型屠宰场屠宰猪群大多来自规模化养殖场。

4 结论

本研究采用PCR 法和ELISA 法，对我国3 个省份进行了屠宰环节猪肉和血清中旋毛虫和弓形虫检测，发现采样地区屠宰生猪旋毛虫和弓形虫感染率较低，基本能够保证猪肉的食品安全；部分省份，特别是中小型屠宰场屠宰生猪存在一定的感染抗体，需要进一步加强此类猪群饲养环节的寄生虫感染控制。本研究对保障猪肉食品安全及寄生虫感染控制提供了依据。