黎 军，刘 倩，蒋家霞，段群棚，卢冰霞，林昌华，秦毅斌，赵 武，何 颖，5，陈忠伟

（1.广西兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001；2.玉林市动物卫生监督所，广西玉林 537000；3.中南大学实验动物学部，湖南长沙 410013；4.广西农垦永新畜牧集团新兴有限公司，广西柳州 545112；5.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005）

近年来，随着规模化、集约化畜禽养殖的发展以及畜产品流通渠道的增多，猪传染病的发生日趋复杂化，对养猪业危害严重。在当前的规模化养殖中，猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）是威胁我国生猪产业的主要病毒性病原[1-2]。刘涛等[2]对2014—2016 年豫南地区规模化猪场主要猪病毒性传染病进行流行病学调查，发现PCV2、PRRSV、PEDV、CSFV、PRV 平均感染率分别为24.47%、22.72%、14.85%、13.59%、13.30%；胡帅等[3]2013—2014 年从广西各地市收集410 份样品进行检测，发现PRRSV、PCV2 及两者混合感染是危害广西养猪业最严重的病毒性传染病病原，同时在高发季节还与CSFV、PRV、PEDV 以及细菌发生混合感染。CSFV、PRRSV、PCV2、PRV 主要引起猪繁殖障碍，导致母猪不孕，妊娠母猪早产、流产以及产死胎、弱胎、木乃伊胎等，可导致初生仔猪、断奶仔猪、育成猪大批死亡，或者出现发热、咳嗽、严重呼吸困难等症状[4]，均能使猪群免疫力下降或接种疫苗后免疫应答反应差，4 种病原单独感染或混合感染均能引起腹泻、繁殖障碍、呼吸道疾病等[5-6]；PEDV 可引起猪严重腹泻、呕吐、脱水为主要特征的高度接触性肠道传染病（PED）[7]。PED 主要发生在冬季，夏季也可发生，每年12 月至次年2 月为我国高发季节。我国从20 世纪80 年代初开始陆续有PED 发生，现已成为重要的猪病毒性腹泻病之一，严重困扰养猪业健康发展，给养猪业造成巨大经济损失[7-8]。为了解广西地区规模猪场上述5 种病毒的感染情况，2015—2019 年，对广西地区14 个地市1 010 个规模猪场采集病死猪组织样本，采用RT-PCR/PCR 方法进行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PEDV 5 种病毒的抗原检测，分析5 种病原的检出率、混合感染情况以及不同地区、不同季节的差异，以揭示广西地区规模化猪场主要病毒性传染病的流行特点及规律，从而为此类疫病防控措施的制定提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2015 年3 月—2019 年3 月，采集自南宁、玉林、桂林、百色、柳州、贵港、北海、崇左、来宾、贺州、钦州、河池、防城港、梧州14 个地级市1 010个规模猪场的2 104 份病死猪病料（包括脑、肺、脾、肾、淋巴结和小肠等）。按照中国动物疫病预防控制中心《关于印发2015 年国家动物疫病定点监测实施方案的通知》，将1 010 个猪场分为大型猪场（存栏量＞1 000 头）、中型猪场（100头＜存栏量≤1 000 头）和小型猪场（30 头＜存栏量≤100 头），详见表1。

表1 2015—2019 年广西14 个地级市规模猪场样本采集数量 单位：份/个

1.2 主要试剂

DL 2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、反转录试剂（PrimeScript RT reagent Kit），均为大连宝生物工程有限公司产品；病毒基因组DNA/RNA 快速抽提试剂盒，为Axygen 生物科技有限公司产品。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中公开发表的各病毒基因序列，利用Meg Align（DNAstar）、Primer Premier 7.0 软件设计引物，并由生工生物工程（上海）服务有限公司合成。引物信息见表2。

表2 5 种病毒的引物信息

1.4 病料处理及病毒DNA/RNA 提取

取适量病死猪病料（脑、肺、脾、肾、淋巴结和小肠等）放于研磨器中，按质量比1:5 加入灭菌生理盐水，在组织研磨器内进行研磨使其呈糊状，然后移入灭菌EP 管中，反复冻融3 次，4 ℃条件下10 000 r/min 离心5 min，取上清进行DNA/RNA抽提或保存于-70 ℃冰箱备用。按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 使用说明书，对样品上清进行DNA/RNA 提取，对所获得的DNA/RNA 直接进行PCR/RT-PCR 或置于-70 ℃保存。

1.5 病毒目的基因片段扩增

1.5.1 CSFV、PRRSV 和PEDV 的RT-PCR 检测 利用特异性引物，对提取的样品RNA 进行RT-PCR 扩增。反转录体系10 µL：RNA 模板7 μL，5×Prime-ScriptTM缓冲液2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，下游引物0.5 μL。反转录条件：42 ℃40 min，94 ℃ 5 min，反应产物于-20 ℃保存备用。PCR 扩增体系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，反转录产物（cDNA）3 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，按表2 退火温度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取10 μL PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后在凝胶成像系统上观察。

1.5.2 PCV2 和PRV 的PCR 检测 利用特异性引物，对提取的样品DNA 进行PCR 扩增，PCR 扩增体系同1.5.1。PCV2 的PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，按表2 退火温度退火40 s，72 ℃延伸70 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。PRV 的PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，按表2 退火温度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。

1.6 数据处理与分析

利用广西兽医研究所病毒室建立的PCR/RTPCR 检测方法，对采自14 个地级市的2 104 份样品，分别进行CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PEDV 5种病原检测，并分析病原的混合感染情况及其地区和季节分布特点。同一份样品同时检测到2 种病原归为二重感染，同时检测到3 种病原归为三重感染，依次类推。使用SPSS 19.0 软件，分析5 种病原感染的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR/PCR 检测

上述5 种病原经特异性引物扩增，PCR 产物电泳后，在紫外线光下可观察到大小分别为288 bp（CSFV）、738 bp（PRRSV）、1 154 bp（PCV2）、217 bp（PRV）和492 bp（PEDV）的目的条带（图1），分别与预期片段大小相符，表明本试验设计的引物特异性强。

2.2 时间分布

年度统计结果（表3）显示：2015—2019 年，每年均能检出PRRSV、PEDV、PCV2、CSFV 和PRV，其中PRRSV、PEDV 和PCV2 的平均检出率分别为29.88%、27.75%和24.60%，显著高于CSFV 的11.12% 和PRV 的4.34%（P＜0.05）；总体来看，5 种病原的年度分布特征不明显，仅PEDV 2016 年平均检出率（41.77%）显著高于其他年份（P＜0.05），CSFV 2017年平均检出率（2.25%）显著低于其他年份（P＜0.05）。

图1 5 种病原RT-PCR/PCR 检测结果

表3 广西规模猪场5 种病毒不同年份的检出率 %

季度统计结果（表4）显示：PRRSV 和PRV季节性特征较明显，PRRSV 秋季检出率（42.56%）和PRV 春季检出率（19.26%）显著高于其他季节（P＜0.05），其他病原季节性特征不明显（P＞0.05）。

2.3 区域分布

地区统计结果（表5）显示，14 个地级市均可检测到上述5 种病原，以PRRSV、PEDV 和PCV2 为主。其中：南宁、玉林、崇左和河池等地的PRRSV 检出率，来宾、北海、百色、贵港、梧州的PEDV 检出率均在30%以上；钦州PCV2 检出率较高（40.48%），其他均在30%以下；各地市CSFV 和PRV 检出率较低，均在20%以下。总体来看，南宁、玉林、桂林、百色、柳州、贵港、崇左、北海等地的病原检出率相对较高。

2.4 群间分布

不同类型猪场统计结果（表6）显示：不同类型猪场均可检测到以上5 种病原。其中：大型猪场PEDV 检出率最高，为46.21%；而小型猪场除PEDV 检出率最低外，其他病原检出率相对较高；中型猪场的各病原检出率普遍低于小型场，但大于大型场。

2.5 混合感染

混合感染统计结果（表7）显示：二重感染检出率最高，其次是三重感染，四重感染较少，无五重感染情况；二重感染以PRRSV+PCV2、PRRSV+PEDV、PCV2+CSFV 和PCV2+PRV为主，平均检出率分别为9.02%、1.39%、1.39%和1.29%，与其他混合感染差异极显著（P＜0.01）；三重感染以PRRSV+CSFV+PCV2、PRRSV+CSFV+PRV 和PRRSV+PCV2+PRV 为主，平均检出率分别为2.62%、0.38%和0.32%，与其他混合感染相比差异显著（P＜0.05）。另外，四重感染在5 年间仅检测到3 例，分别 是“CSFV+PRRSV+PCV2+PRV”2 例、“CSFV+PRRSV+PRV+PEDV”1 例。

表4 广西规模猪场5 种病毒不同季节的检出率 %

表5 广西规模猪场5 种病毒不同地区的检出率 %（份）

表6 5种病毒在广西不同规模类型猪场的检出率 %（份）

表7 广西规模猪场 5 种病毒混合感染检出率 %

3 讨论

近年来，猪群病毒性疫病已成为危害我国养猪业最主要的因素，并且从近几年农业农村部发布的全国生猪疫情通报分析可知，在多重感染的疫病中，80%是病毒性疫病[9-10]，尤其是猪繁殖障碍性疫病，已成为制约我国养猪业可持续发展的瓶颈。常见的猪繁殖障碍性疫病病原主要有CSFV、PRRSV、PCV2、PRV 等[4]，它们与引起猪大规模流行性腹泻的PEDV[11-13]，构成了养猪生产中主要的5 种病毒性病原。这些病原常以单独或混合感染方式在猪群中迅速传播，给养猪业造成巨大经济损失[14]。本次检测发现，这5 种病原在广西14 个地市1 010个不同规模猪场的病死猪样本中均有检出，以南宁、玉林、桂林、贵港、百色、柳州、崇左和北海地区的检出率最高，说明这5 种病原对这些地区的生猪养殖业影响较大。这可能与上述地区为广西主要的生猪养殖产区，养殖密度较高且猪病情况较为复杂有关，当然也与这些地区检测样品数量偏多有关。

杨汉春[15]指出同一个猪场使用两种（不同毒株）以上的活疫苗，免疫次数过频会加剧变异毒株间、疫苗毒株间以及疫苗毒株与野毒株间的重组风险，从而大大加快新毒株的产生，会使我国的猪繁殖与呼吸综合征越来越复杂。本次检测发现，PRRSV 平均检出率最高，说明PRRSV 是侵害广西地区养猪业的主要病原之一。这与PRRSV 自身变异较快，不断出现新毒株，导致疫苗株与当地流行毒株间存在抗原性差异，使得宿主不能抵抗野毒感染有关[3]。从年份上看，PRRSV 检出率居高不下，与冯松林等[16]对2014—2016 年广东省规模化猪场PRRSV 的流行病学调查结果相似。另外，PRRSV主要侵害宿主呼吸系统，因而季节因素对该病影响显著（P＜0.05），以秋冬季节转换时病原检出率最高，说明寒冷因素在一定程度上能促进PRRSV 在规模猪场的感染。从PRRSV 感染类型分析，存在与其他病原的混合感染，主要是与PCV2 的二重感染，与PCV2 和CSFV 的三重感染；另外，本次检测还发现3 例PRRSV 与其他病原的四重感染。有研究[17]认为，PRRSV 主要在猪单核巨噬细胞内复制，尤其是肺泡巨噬细胞，然后进一步扩散到全身多处组织的巨噬细胞和单核细胞，使宿主免疫力降低，从而产生免疫抑制，促使其他多种病毒感染的发生，引起混合感染并最终导致猪的死亡。

2016 年朱子健等[18]对东北地区88 个疑似病毒性腹泻猪场的调查结果显示，疫情多发生在冬春寒冷季节，且以PEDV 感染为主（48.86%）。李任峰等[19]对2018 年河南省新乡地区5 个县55 个猪场351 份病料的检测结果表明，PEDV 感染率为冬季较高。本检测发现，PEDV 平均检出率仅次于PRRSV，但季节因素对 PEDV 检出率无明显影响，只是春、冬季节偏高，与上述研究结果相符。本检测还发现，PEDV 较少与其他病原发生混合感染。目前广西的PEDV 流行仍较为严重，规模猪场在冬季应做好猪场防寒保暖工作，合理制定免疫预防策略，综合防控PEDV 流行。

PCV2 感染也是规模猪场存在的主要问题。本检测发现：该病原的平均检出率仅次于PRRSV 和PEDV，说明其感染在广西也十分普遍；季节因素对PCV2 感染影响不大，且以混合感染为主。这可能是由于PCV2 为免疫抑制性病原，它既能在其他免疫抑制性病原感染宿主后继发感染，又能在宿主感染PCV2 后继发感染其他病原。本检测发现，PCV2 的混合感染主要为二重感染，且分别与PRRSV、CSFV 和PRV 的混合感染最多（P＜0.05）。PCV2 是免疫抑制性病原，容易造成宿主免疫力低下，从而引起猪瘟疫苗和伪狂犬病疫苗免疫失败而感染野毒[20-21]。规模猪场应该加强母猪群和仔猪群PCV2 疫苗免疫，以有效降低此类疫病发病率。

从本次检测结果来看，广西地区规模猪场的猪瘟和伪狂犬病防控效果相对较好。猪瘟是我国生猪养殖中的强制免疫病种，这在一定程度上减少了其大量发病和区域性大流行的发生。CSFV 平均检出率2017 年降至最低（P＜0.05），但现在有所抬头，这可能与2017 年猪瘟疫苗不再纳入中央政府补贴的强制免疫有关[22]。PRV 平均检出率最低，各年度无明显差异，但季节因素对该病影响显著（P＜0.05），以春季和秋冬季节检出率较高，这符合PRV 多流行于寒冷多雨或是气温多变的秋冬、初春季节的特点[23]。

目前，我国生猪养殖仍以中小型养殖为主，占一半以上。从本次检测情况看，生猪存栏量≤1 000头的中小型养殖场占比为80.10%，这从侧面反映出广西地区的生猪集约化饲养程度远低于全国平均水平[24]。集约化养殖、规范化管理的大型猪场疫苗免疫程序科学，并定期进行抗原抗体监测，及时淘汰阳性猪，所以平均病原检出率普遍较低，如CSFV 和PRV 的检出率很低。而这5 种病原在广西地区中小型养殖场中检出率都较高，因此中小型猪场需要提高生物安全意识，规范生产管理，严格落实防疫制度，做好这5 种猪病毒性抗原的检测和监测，及时清除带毒猪并加强免疫，降低此类疫病的发生风险[25]。

4 结论

2015—2019 年广西14 个地市不同规模类型猪场均存在CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PEDV感染，局部地区和小型猪场流行较为严重，以PRRSV、PEDV 和PCV2 感染为主；季节因素对PRRSV 和PRV 感染影响显著，PRRSV 主要流行于寒冷季节，PRV 主要流行于春季；多病原混合感染现象较为普遍，以PCV2 分别与PRRSV、CSFV 和PRV 的二重感染最为常见。广西地区需要加强这5 种猪病的免疫和监测，对其实施重点防控。