王静静，于晓慧，罗瑶瑶，李 阳，蒋文明，刘华雷，王志亮

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266114）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽传染病。NDV 强毒株可导致感染禽类出现典型症状和病理变化，病死率可高达100%，给养禽业造成严重经济损失，为此世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，并在《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020 年）》中，将其列为优先防治的重大动物疫病。NDV 具有遗传多样性。根据病毒F基因序列差异，NDV可分为I 类（class I）和II 类（class II），其中I类只有1 个基因型，II 类至少有21 个基因型（I—XXI）。我国流行的NDV 强毒株主要为II 类中的基因VI 型和VII 型[1-2]。1984 年，我国台湾地区首次发现基因VII 型NDV。随后，该基因型毒株在我国家禽中广泛流行，主要为基因VII.1.1 亚型。2011 年，我国在广西野鸟中首次分离到基因VII.2 亚型NDV。国家新城疫参考实验室监测数据显示，2012—2018 年我国陆续在家禽中也分离到VII.2 亚型毒株。为了解我国家禽中流行的基因VII型NDV 的分子生物学特性，对2014—2018 年分离的5 株基因VII 型NDV 代表株进行了基因组测序和序列分析，以期为进一步掌握我国基因VII 型NDV 的遗传特性以及科学防控ND 奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒繁殖

SPF鸡胚，购自山东省无特定病原实验种鸡场。将国家新城疫参考实验室保存的基因VII 型NDV代表株接种9～11 日龄SPF 鸡胚，72 h 后，通过血凝（HA）试验鉴定鸡胚尿囊液，将鉴定为HA 阳性的尿囊液分装，于-80 ℃保存。

1.2 RNA 提取

用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，并立即用于RT-PCR 扩增，或置-20 ℃保存备用。

1.3 病毒基因组扩增

利用SuperScript Ⅲ One-Step RT-PCR PlatinumTaqHiFi（Invitrogen）试剂盒及特异性引物，扩增病毒基因组序列。RT-PCR 反应条件为：50 ℃30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，52 ℃ 30 s，68 ℃ 2.5 min，进行35 个循环；68 ℃延伸5 min。利用SMARTer® RACE 5'/3'Kit（clontech）试剂盒，扩增病毒基因组5'和3'末端。RT-PCR 扩增产物，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.4 基因组序列拼接与分析

利用Lasergene 软件，参考GenBank 中基因VII 型NDV 基因组序列，对测得序列进行拼接和编辑。利用MEGA 6 软件，参考NDV F 和HN 蛋白功能区序列[3]，分析5 株基因VII 型NDV 代表株F 和HN 蛋白关键位点的氨基酸变异。

1.5 基因重组分析

利 用RDP4 软 件，采 用RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq 等算法，对5 株基因VII 型NDV 代表株的基因组序列进行重组分析。

1.6 遗传进化分析

利用MEGA6 软件，对毒株F基因序列进行系统进化分析[1]；采用邻位相连法（neighbor-joining）构建系统进化树，bootstrap 设置为1 000 次重复。

2 结果

2.1 基因VII 型代表株信息

从2014—2018 年我国分离到的35 株基因VII型NDV 中，选取5 株代表株进行基因组测序。代表株分离时间、地点、宿主等信息见表1。

表1 基因VII 型NDV 代表株信息

2.2 基因组序列分析

对筛选的5 株基因VII 型NDV 代表株进行基因组测序和序列分析。5 株病毒基因组长度均为15 192 nt。如表2 所示：分离株基因组3'和5'端长度分别为55 和114 nt，NP、P、M、F、HN和L基因5'端非转录区（untranslated region，UTR）均长于3'UTR；NP—P、P—M、M—F基因间隔区（intergenic sequence，IGS）长度为1 nt，F—HN、HN—L的IGS 分别为31 和47 nt。利用RDP4 软件，对病毒基因组序列进行分析，未发现基因重组。

5 株病毒F 蛋白长度均为553 aa，与基因VII型NDV 基因组长度特征一致（表2），裂解位点处有4 个以上碱性氨基酸（表1），符合强毒株特征。与大部分NDV 相似，5 株病毒F 蛋白有6 个潜在的N-糖基化位点（N-X-S/T）。与NDV F 蛋白功能区参考序列相比[3]，JS1816/2014 和SD142/2015的F 蛋白融合肽（fusion peptide）序列相对保守，但在七肽重复区（heptad repeat region，HR）和跨膜区（transmembrane domain）有多处氨基酸变异；其余3 株病毒在融合肽、七肽重复区和跨膜区均出现氨基酸变异，其中YN1027/2016 和YN1135/2017 各有6 个氨基酸变异，YN2073/2018有5 个氨基酸变异（表3）。

5 株病毒HN 蛋白长度均为571 aa，与基因VII 型NDV 基因组长度特征一致（表2），有5个N-糖基化位点，分别为119（NNS/NSS）、341（NNT/NDT）、433（NKT）、481（NHT）、508（NIS），跨膜区有多处氨基酸变异（表3）。与NDV 疫苗株（La Sota、V4、Clone 30、B1）相比，YN1027/2016 和YN1135/2017 在HN 蛋白中和抗原表位有2 个氨基酸变异（N263R，I514V），YN2073/2018 有3 个氨基酸变异，增加了Q348H，JS1816/2014 和SD142/2015，各有4 个氨基酸变异，且其E347 位也发生了变异（表4）。

2.3 遗传进化分析

对基因VII 型代表株F基因进行遗传进化分析，发现我国基因VII 型分离株具有遗传多样性：2014—2015 年分离的2 株病毒属于基因VII.1.1 亚型，2016—2018 年分离的3 株病毒属于基因VII.2亚型（图1）。

3 讨论

NDV 具有遗传多样性，根据病毒F基因差异，NDV 可分为两大类：I 类大多为弱毒株；II 类毒力差异较大，既有引发大流行的强毒株，也有常用弱毒疫苗株。根据最新的基因分型方法，I 类NDV只有1 个基因型、3 个基因亚型；II 类NDV 至少包括21 个基因型[1]。目前，我国流行的NDV 强毒株主要为基因VI 型、VII 型，且具有较强的宿主特异性。基因VI 型NDV 主要分布于鸽群，基因VII 型主要分离自鸡和水禽。20 世纪90 年代后，基因VII.1.1 亚型NDV 开始在我国家禽中广泛流行。2011 年，我国在广西野鸟中首次分离到基因VII.2 亚型NDV。这种新型病毒2005 年首次出现于马来西亚，随后在印度尼西亚、越南、柬埔寨、南非共和国和莫桑比克等东南亚和非洲国家也分离到该亚型毒株[4-8]。2012 年我国在贵州省鸡群中分离到基因VII.2 亚型NDV，2013—2018 年又陆续在鸡和水禽（鸭、鹅）中分离到同类病毒。国家新城疫参考实验室监测数据显示，2016 年至今，我国基因VII 型NDV 分离株主要为基因VII.2 亚型，暗示此亚型毒株可能已逐步取代基因VII.1.1亚型，成为家禽中的优势流行毒株。

表2 基因VII 型NDV 的基因组长度特征

表3 F 和HN 蛋白功能区氨基酸变异情况

表4 HN 蛋白中和抗原表位氨基酸变异

NDV 为单股负链RNA 病毒，基因组由6 个基因片段（NP、P、M、F、HN、L）组成，至少包括3 种长度[9]。I 类NDV 基因组长度为15 198 nt，II类为15 186 nt（基因I—IV 型）或15 192 nt（基因V—XXI 型）。本研究中的5 株基因VII 型NDV代表株基因组长度均为15 192 nt。NDV F 蛋白裂解位点氨基酸与病毒毒力相关[10-11]。5 株病毒F 蛋白裂解位点为112RRQKR/F117或112RRRKR/F117，均符合强毒特征，且其HN 蛋白长度均为571 aa，与大部分NDV 强毒株一致[12]。NDV F 蛋白七肽重复区和跨膜区氨基酸变异可影响病毒F 蛋白融合活性，HN 蛋白中和抗原表位氨基酸变异可协助病毒逃避宿主免疫应答[3，13-14]。本研究中，5 株病毒在F 蛋白七肽重复区和跨膜区，以及HN 蛋白跨膜区和中和抗原表位均有氨基酸变异，且JS1816/2014出现与病毒免疫原性相关的E347K 变异[15]。

图1 基因VII 型NDV F 基因进化树

2014—2018 年，我国在鸡群和鸭群中分离到多株基因VII 型NDV，且各分支中，不同宿主来源病毒的F基因高度同源，说明基因VII 型NDV可在家养陆禽和水禽间传播。目前，分离到的基因VII 型NDV 均来源于活禽市场。由于活禽市场家禽种类多、来源复杂，市场卫生条件较差，极易导致病毒传播和混合感染，因此应加强活禽市场的生物安全管理，严格执行消毒、休市等措施。同时，也应加强活禽市场的NDV 监测，并进一步研究NDV 强毒株的生物学特性，为科学防控ND 提供依据。