王慧煜，郑家昊，梅 琳，孔玉方，林祥梅，杨 素，韩雪清

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.天津中医药大学，天津 301617；3.拱北海关技术中心，广东珠海 519020）

流感病毒属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），为单股、负链、分节段RNA 病毒。根据核蛋白（nucleocapside protein，NP）和基质蛋白（matrix protein，M）的不同，流感病毒可以分为A、B、C、D 4 个型别[1]。其中A 型流感病毒对人类威胁最大，不仅可以通过抗原转移（antigenic drift）造成每年的季节性流行，而且会通过抗原转变（antigenic shift）造成大流行。根据A 型流感病毒表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）蛋白结构及其基因特性的不同，A 型流感病毒又可分为许多血清型，目前已发现的HA 有18 个（H1—H18），NA 有11个（N1—N11）[2-3]。除可感染人外，A 型流感病毒还能感染多种动物宿主，包括野鸟、水禽、鸡、狗、马和猪等[4-6]，而且不同来源的HA 和NA 编码基因能重配组合成上百种不同亚型的病毒，并可在不同宿主间传播[7]。流感是传播性极强的传染病和人兽共患病，是世界卫生组织（WHO）、世界动物卫生组织（OIE）等联合倡导全球共同防控的重大疫病。

由于A 型流感病毒亚型众多，常规检测方法，如多重RT-PCR 等无法检测已经发现和可能发生变异的所有亚型。为解决这一棘手问题，本研究室成功研制出针对A 型流感病毒各亚型的基因芯片分型检测方法[7-8]，能在同一张芯片上准确鉴定A 型流感病毒的H1—H16 和N1—N9 亚型。为验证该方法在实际中的应用效果，以及初步了解流感病毒各亚型在我国不同地区和不同宿主中的分布情况，对20 个地区、不同宿主源（鸡、鸭、鹌鹑、鸽子、猪、人等）的16 852 份拭子和组织样品进行了检测，以期为流感的有效监控和应对新疫情暴发提供可靠的技术手段。

1 材料

1.1 样品

收集自全国20 个省（自治区、直辖市）的16 852 份样品，包括鸡、鸭、鹌鹑、猪、人等的棉拭子及组织疑似样本。

1.2 主要试剂和耗材

QIAGEN OneStep RT-PCR Kit、QIAamp®Viral RNA mini Kit（52904）、RNeasy® Mini Kit（74104），均购自QIAGEN 公司；2×SmartHyb杂交液，购自北京美莱博医学科技有限公司；杂交围栏，购自博奥（北京）生物技术有限公司。通用引物Uf：TCACTTGCTTCCGTTGAGG；通用引物Ur：TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGT。引物均由上海生工生物公司合成。

1.3 主要仪器

高速微量离心机（Sigma，USA）；水浴锅（PolyScience，美国）；涡旋仪（江苏海门市其林贝尔公司）；生物安全柜（NU，美国）；恒温鼓风干燥箱（中国智成）；Eppendorf Mastercycler PCR 仪（Eppendorf AG，德国）；PerkinElmer ScanArray Gx plus（PE，美国）。

2 方法

2.1 核酸提取

拭子样品和组织样品分别按照QIAamp® Viral RNA mini Kit 和RNeasy® Mini Kit 操作说明进行样品核酸提取，-20 ℃保存备用。

2.2 多重不对称RT-PCR

反应体系：Onestep RT-PCR buffer（5×）10.0 μL、dNTP（10 mmol/L）2.0 μL、Enzyme mix 2.0 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、RNA 模 板5.0 μL、特异性上游引物（10 μmol/L）0.5 μL、特异性下游引物（10 μmol/L）1.0 μL、通用引物Uf（10 μmol/L）0.5 μL、通用引物Ur（10 μmol/L）10.0 μL，加ddH2O（RNase-free）至50 μL。

反应条件：50 ℃反转录30 min；95 ℃15 min；94 ℃ 20 s，52 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共20个循环；94 ℃ 20 s，70 ℃ 90 s，共20 个循环；72 ℃延伸10 min。

2.3 杂交

取扩增产物5.2 μL、杂交质控探针0.8 μL 和2×SmartHyb 杂交液6 μL 于0.2 mL PCR 管中，混匀；95 ℃变性5 min，立即冰浴3 min，4 000 r/min离心5～10 s，然后将离心管放回冰浴；在杂交盒的沟槽中加入200 μL 蒸馏水，以防止杂交体系蒸发，然后将芯片正面向上放入盒中；将已变性的杂交样品从冰盒中取出，用枪头轻轻吹吸3～5 次后，取7 μL 杂交混合液加到探针点阵区，迅速盖上盖片和杂交盒并密封；将杂交盒水平放入52 ℃的水浴锅中，杂交2.5 h。

2.4 洗涤

杂交结束后，立即将芯片取出，放入预热至45 ℃的洗涤液Ⅰ中，100 r/min 水平振荡洗涤5 min，相同条件重复1 次；取出芯片，放入预热至45 ℃的洗涤液Ⅱ中，100 r/min 水平振荡洗涤5 min，相同条件重复1 次；取出芯片，放入洗液Ⅲ中，100 r/min 室温振荡5 min；将芯片在无水乙醇中浸提5 s，然后把芯片放入芯片盒中，1 000 r/min 离心5 min。

2.5 结果判定

用基因芯片扫描仪进行芯片扫描（波长532 nm、PMT 60%、激光能量90%，扫描仪参数不作硬性规定）。

在试验结果成立的前提下，如果样品RT-PCR产物经杂交后，在各自的位置上出现特异性荧光信号，则判定为A 型流感病毒各个亚型（包括HA和NA）核酸阳性。每条探针有2 个重复位点，出现2 个或2 个以上荧光信号者判为该亚型核酸阳性；出现1 个荧光信号需进行重复试验再次读判，如果仍出现1 个荧光信号，就判为可疑，可采用普通RT-PCR 方法加序列测定和荧光定量RT-PCR 方法等进一步验证。如果只有HA 或者只有NA 位点出现荧光信号，或者2 个以上HA 或NA 亚型位点出现荧光信号，都判定为该亚型核酸阳性。

3 结果

应用分型基因芯片技术，共检测样品16 852份，检出阳性2 582 份，阳性检出率为15.32%，共检测到H1N1、H2N9、H3N2、H4N6、H5N1、H7N1、H7N9、H9N2、H10N5、H16N3 等10 个亚型，均与阳性样品序列测定结果一致（表1）。在所有阳性样品中，H5N1 亚型检出率最高，为33.54%，其次是H7N1，检出率为22.31%。各亚型阳性检出情况见表2，不同地区阳性检出情况见表3。

表1 不同宿主样品检测结果 单位：份

4 分析与讨论

本研究采集了我国从东到西、从南到北20 个省（自治区、直辖市）部分地区养殖场、活禽市场和出入境口岸的不同动物样品以及人类样品，利用研制的A 型流感病毒分型基因芯片进行筛查，对检出的阳性样品，同时进行测序鉴定，发现芯片检测结果与测序结果一致，进一步证明了所建立方法的可靠性。该检测方法在一张基因芯片上集成了A型流感病毒H1—H16 和N1—N9 的52 条特异性探针，针对每个亚型有2～4 条探针，而且每条探针又有2 个重复位点，因此可迅速、准确定型分析流感病毒的不同亚型，也能检测到变异重组的流感病毒株。总之，该基因芯片检测方法不仅有助于A 型流感疫情的有效监控，也可在第一时间内准确发现流感病毒基因重排的流行亚型，从而为及时应对新疫情暴发提供了可靠的技术储备。

表2 各亚型阳性样品检出结果统计

A 型流感在不同宿主间跨种传播时，会产生新重配病毒，而导致历次流感大流行的病毒都是来自不同宿主的流感病毒重配后产生的新病毒。1957年亚洲流感大流行和1968 年我国香港流感大流行的病原均为当时人群中流行的流感病毒与禽流感病毒重配后产生的新病原；2009 年的A 型H1N1 流感病毒也是人-猪-禽流感病毒的重配病毒。由于A 型流感病毒宿主范围广，因此从流感病毒的自然生态分布来看，流感大流行的发生是难以避免的。目前能做到的就是加强监测，及早发现可能导致流感大流行的新型病毒，从而将流感大流行的危害降到最低[9]。

表3 不同地区样品检测数量及检出亚型分布

2013 年以前，国际上已报道了人感染H5N1、H7N7、H7N3、H7N2、H9N2、H10N7 等亚型禽流感的病例；2013 年春季起，我国出现人H7N9 流感病例[10]，同年12 月在江西省南昌市确诊了全球首例人H10N8 禽流感病例[11]。最近几年，高致病性禽流感在全球广泛发生，其中H5N1、H5N3、H5N6 和H5N8 等亚型在我国均有流行，而H5N1亚型还见于亚洲其他国家和非洲，H5N2 亚型还见于北美洲，H5N6 亚型还见于东南亚国家等。H5N8 亚型独立流行于东亚、西欧和北美3 个地区[12]。低致病性禽流感呈全球散发状态，除H5 和H7 亚型外，个别地区出现其他亚型，如H9N2、H10N8、H10N7、H11N2 等[13-14]。本研究检测到了一些不常见亚型的流感病毒，如H10、H16 等。

针对上述不常见亚型病毒的分离工作，将是后续工作的重点，尤其需要加强活禽市场的流感病毒监测。既往研究[15]提示，活禽市场在禽流感病毒的保存、繁殖和传播中起着至关重要的作用，是禽流感病毒基因混合池，为不同亚型禽流感病毒基因重组提供了有利条件，是人感染禽流感病毒的主要源头，也是预防和控制禽流感的关键所在。