邢乐康，邓永东，姚立琼，金凤玲

肝硬化是临床常见的慢性肝病，乙型肝炎病毒(HBV)感染为该病的主要病因之一。肝硬化后期常引起消化道出血、肝性脑病和腹水等一系列并发症，导致患者死亡。现有众多研究[1]表明乙型肝炎肝硬化患者肠道菌群会发生变化，并通过“肠-肝轴(gut-liver axis)”[2]使肝脏Kupffer细胞吞噬功能受损和炎症因子释放，导致肝脏结构进一步破坏，加重疾病的严重程度。有研究表明[3]膳食结构会影响肠道菌群的变化，研究不同地区不同程度乙型肝炎肝硬化患者肠道菌群变化的特点对治疗有重要的意义。本研究分析了乙型肝炎肝硬化患者肠道菌群的变化特征，旨在为临床治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2018年7月～2019年4月我院收治的乙型肝炎肝硬化患者103例，男68例，女35例；年龄26～61岁，平均年龄为(46.4±3.1)岁。诊断符合中华医学会肝病学分会和感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》 (2015年版)[4]的标准，其中代偿期41例，失代偿期62例。入组患者在纳入研究一个月前均未接受抗生素或肠道菌群调节药物治疗。另选择在本院体检的健康志愿者20例，男11例，女9例；年龄21～59岁，平均年龄为(44.6±4.1)岁。本研究经兰州大学第一医院医学伦理委员会审核通过，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 肠道菌群检测 采用Illumina Miseq高通量测序方法检测肠道菌群序列(上海凌恩生物技术公司)，并提取高质量序列，对其进行OTU聚类分析和物种分类学分析，分析多样性指数和群落结构。大致测序过程如下：(1)抽提基因组DNA，完成后在1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提基因组DNA；(2)进行PCR扩增，按照指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，并在2%琼脂糖电泳进行检测。PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase。使用ABI GeneAmp© 9700型PCR扩增仪；(3)参照电泳初步定量结果，将PCR产物进行荧光定量检测；(4)构建Illumina PE250文库。对测序结果进行overlap关系拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，并进行OTU聚类分析和物种分类学分析。在上述分析的基础上，再对一系列群落结构和系统发育等进行深入的统计学和可视化分析。

2 结果

2.1 菌群结构分布分析 基于门等级水平，通过研究共鉴定出15种细菌，其中厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)分别占总数的62.3%和26.2%，其次为梭菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，共占比为10.7%，而黏胶球菌形菌门(Lentisphaerae)、酸杆菌门(Acidobacteria)、互养菌门(Synergistetes)、广古生菌门(Euryarchaeota)和奇古生菌门(Thaumarchaeota)等含量极低。在健康人、代偿期和失代偿期肝硬化组，厚壁菌门和拟杆菌门分别为70.9%和64.2%、57.7%和18.6%，和26.7%和28.9%；在属分类等级水平上，我们共鉴定出300余种细菌，其中占比最高的为拟杆菌属(Bacteroides)占14.5%，其次为粪杆菌属(Faecalibacterium)占10.2%和巨单胞菌属(Megamonas)占8.4%，而普氏菌属(Prevotella )、韦荣球菌属(Veillonella)和罗斯氏菌属(Roseburia)等占比较低，均小于5%；在健康人，巨单胞菌属、拟杆菌属和粪杆菌属比例较高，分别为14.8%、11.4%和9.8%。在代偿期肝硬化组，拟杆菌属、粪杆菌属和巨单胞菌属比例分别为15.2%、11.5%和11.2%。在失代偿期肝硬化组，拟杆菌属、粪杆菌属和韦荣球菌属比例分别为16.9%、9.6%和9.2%。

2.2 肠道菌群多样性分析 在群落生态学中研究微生物多样性，通过单样本的多样性分析(Alpha多样性)可以反映微生物群落的丰度和多样性，通常运用Chao指数来计算菌群丰度。Chao指数在生态学研究中常用来估算物种总数，而运用Shannon和Simpson指数来计算菌群多样性，Shannon指数越高，说明菌群多样性越高，而Simpson指数越高，说明菌群多样性越低。研究发现，健康人Chao指数显著高于代偿期肝硬化组和失代偿期肝硬化组，差异有统计学意义(P<0.05)。因此，与健康人群比，失代偿期肝硬化患者肠道菌群丰度明显降低，且失代偿期肝硬化患者肠道菌群丰度显著低于代偿期肝硬化患者。经方差分析，健康人Shannon指数显著低于代偿期肝硬化组和失代偿期组，差异有统计学意义(P<0.05)。健康人Simpson指数显著大于代偿期和失代偿期肝硬化，差异有统计学意义(P<0.05，表1)，而稀释曲线趋于平坦(图1)，说明测序结果可反映样本菌群的多样性。对样本进行PCOA分析后发现，大部分失代偿期乙型肝炎肝硬化患者肠道菌群存在聚集，与健康人和代偿期肝硬化患者有明显差异，第一主成分贡献率为23.7%，第2主成分贡献率为18.7%(图2)。

表1 肝硬化与健康人肠道菌群丰度和多样性比较

与健康人比，①P<0.05

图1 研究对象肠道菌群稀释曲线

图2 研究对象肠道菌群PCOA分析

2.3 肠道菌群差异分析 LEfSE分析方法采用线性判别分析(LDA)估算每个组分(物种)丰度对差异效果影响的大小，通过分析可以发现组间差异显著的菌种。本研究在健康人，厚壁菌门中的毛螺菌科Lachnoclostridium属和Ruminococcaceae科Ruminiclostridium-5属对菌群差异起到重要作用，在失代偿期肝硬化组，厚壁菌门中的Veillonellaceae科Veillonella属起到重要作用(图3)。

图3 失代偿期肝硬化患者与健康人肠道菌群差异分析

3 讨论

肠道菌群是人体重要的定植菌群之一，有着免疫调节、病原体防御和物质代谢等生理功能。一般，正常肠道菌群分为益生菌、中性菌和有害菌。当菌群结构发生改变时，一些炎症介质和内毒素的释放将导致肠道屏障被破坏，引起疾病的发生，且这些有害代谢产物还可通过肠-肝轴运输至肝脏，破坏其结构和并使其功能受损。对肠道菌群进行调节，现已逐渐成为临床治疗肝脏疾病的有效手段之一[5]。

现有众多研究表明，乙型肝炎肝硬化患者肠道菌群结构发生改变，且随着病情的发展而变化[6，7]。本研究结果显示，相对于健康人群，乙型肝炎肝硬化患者肠道菌群中拟杆菌属细菌数量呈升高趋势，厚壁菌门/拟杆菌门细菌比例下降，且与疾病的严重程度呈正比，而巨单胞菌属和粪球菌属细菌数量下降，在失代偿期肝硬化患者中韦荣球菌属细菌数量上升。该研究结果与国内研究报道基本相似[8]，而国外有学者检测发现[9]，乙型肝炎肝硬化患者肠道肠杆菌科、梭杆菌科和产碱杆菌科细菌数量上升，而瘤胃菌科和毛螺菌科细菌数量下降。检测结果可能受到疾病种类和当地饮食习惯的共同影响。巨单胞菌属和粪球菌属细菌均可代谢短链脂肪酸，调节肠道免疫功能和物质代谢[10]，而现已发现瘤胃菌科和毛螺菌科细菌多数含有胆汁酸水解酶，与次级胆汁酸的产生密切相关[11]，而胆汁酸可以刺激肠壁，破坏肠道微生态和机体免疫功能，影响机体对肠道菌群结构的调节。也有研究发现在肝硬化患者肠道内肠杆菌科和拟杆菌科细菌更丰富，且菌群改变程度与疾病发展程度相关[11-15]。

同样，饮食习惯因素也能调节肠道微生物的组成。有国内学者提出[16]，脂肪摄入的数量和类型均会影响肠道菌群的组成，而厚壁菌门细菌含有与脂肪或难消化的多糖代谢相关的基因，故这种菌群与肥胖相关，拟杆菌门的作用与其相反，所以在高脂饮食人群中可能会发生肠道内厚壁菌/拟杆菌比值升高的现象。失代偿期乙型肝炎肝硬化患者肠道微生物多样性明显降低，饮食因素如咖啡、蔬菜和发酵乳的摄入可增加菌群的多样性，而乳果糖和碳酸饮料的饮用将降低肠道微生物的多样性[17]。我国汉族人饮食以米、面食和肉类为主，这种高蛋白质及高脂饮食习惯会造成拟杆菌属细菌数量的上升[18]。

本研究发现，在失代偿期乙型肝炎肝硬化患者肠道中韦荣球菌属丰度上升，而韦荣球菌属可通过与链球菌属的协调作用，从而释放内毒素和炎症因子等，破坏肠道屏障功能[15]，属于条件致病菌导致的肠道菌群结构失衡。失衡的肠道菌群所产生的代谢毒物等可通过“肠-肝轴”对肝脏结构进一步造成破坏[19-21]，同时肠道动力学的改变和胃肠pH环境变化都会导致肝硬化患者病情不断加重而向失代偿期发展。

综上所述，乙型肝炎肝硬化患者的确存在不同程度的肠道菌群结构失衡和数量改变现象。随着病情发展，患者肠道菌群也在发生变化，而菌群失衡常导致病情的加重。目前，有学者提出粪便移植等新兴治疗方法[17]，这些手段还需要更多的探索和观察。不同地区乙型肝炎肝硬化患者肠道菌群特点存在差异，可能与疾病病因、病情、饮食习惯和治疗干预等有关。临床医生可根据具体情况对乙型肝炎肝硬化患者进行个体化的治疗，找到最合适的治疗方案，尽可能减少对肠道菌群的破坏，从而达到更好的疗效。