沈熠，莫岩君，于天源，吕桃桃，罗宇婷，张羽墨，邵帅，李易真

北京中医药大学，北京市 100029

坐骨神经及其分支与小腿、足的运动和感觉密切相关。坐骨神经损伤后，症状以臀部疼痛并向下肢放射，下肢无力、肌肉萎缩，自觉麻木、疼痛[1]，感觉异常为主，临床可采用肌电图和神经传导速度进行诊断和疗效评估[2]，可通过促进坐骨神经修复的药物治疗、物理治疗和手术治疗进行干预。坐骨神经损伤作为周围神经损伤的一种，其恢复机理尚不完全明确，亟需从多角度完善其机理并指导临床。本团队前期研究表明[8-20]，推拿手法干预坐骨神经损伤大鼠可调控多层面、多因子的表达，促进坐骨神经的修复。

神经调节蛋白(neuregulins,NRGs)及其受体原癌基因人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor,HER，又名ErbB)家族与神经发育有关，影响神经回路产生、轴突代偿、神经传递和突触可塑性[3]。周围神经损伤后，此信号与施万细胞和髓鞘密切相关。本研究建立大鼠坐骨神经损伤模型，通过斜板测试评价后肢肌力的恢复情况，通过透射电镜观察坐骨神经损伤点处髓鞘的变化，通过Western blotting法检测坐骨神经损伤点和L4-6脊髓处NRG1及其受体ErbB2的表达，分析比较“三法三穴”推拿手法干预前后的变化，以完善推拿促进周围神经损伤恢复的可能机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠76只，体质量(200±10) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为北京百善SCXK(京)2016-0006，饲养于北京中医药大学屏障环境动物实验室，室温20 ℃，空气相对湿度40%，大鼠自由进食水。实验程序经北京中医药大学动物使用和管理委员会批准，符合动物福利与伦理原则。

采用随机数字法将大鼠分为正常组、假手术组、模型组和推拿组。具体方法：使用Microsoft Excel软件，A列为编号1～76，B列=RAND()并下拉填充，至每个编号都有生成的[0,1]之间一个随机数字，C列为复制数值并升序排列，每组19只动物，记录编号和分组。

1.2 主要仪器与试剂

按摩推拿手法模拟仪：中国专利200710187403.1。自制电动斜板测试仪。Mini-P-2电泳槽、电泳仪：美国BⅠO-RAD公司。MultiSkan3酶标仪：美国THERMO公司。冷冻离心机：德国EPPENDORF公司。水平脱色摇床：海口其林贝尔有限公司。电动组织匀浆器：美国FLUKA公司。预制胶溶液：中国新赛美公司。BCA蛋白定量试剂盒、10X TBST缓冲液、彩虹18-245蛋白Marker、脱脂奶粉、2 mg/ml BSA标准品：中国索莱宝公司。兔源ErbB2抗体、HRP二抗、ECL显影液：英国ABCAM公司。小鼠源NRG1抗体：美国THERMO FⅠSHER公司。戊巴比妥钠：中国国药集团。戊二醛、锇酸、环氧树脂812、醋酸双氧铀、柠檬酸铅：中国中兴百瑞公司。

1.3 造模及干预方法

1.3.1 造模

模型组和推拿组使用坐骨神经夹持损伤法进行造模。造模前12 h禁食，器械消毒。1%戊巴比妥钠溶液3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，注意回抽，至疼痛反射消失。备皮并常规消毒手术区域。于大鼠右侧臀股交界处，纵向切口约0.5 cm。眼科剪钝性分离，以弯钩镊找到并暴露、分离坐骨神经。使用同一把特制无齿持针器，于梨状肌下缘5 mm处满扣夹持5 s后松开，满扣力量约6 N，最终形成约2 mm宽的神经损伤点。缝合后碘伏消毒。术后注意护理。假手术组仅分离后暴露坐骨神经5 s，不夹持。

1.3.2 干预

术后7 d推拿组开始干预，干预前适应环境0.5 h。采用按摩推拿手法模拟仪分别于推拿组术侧殷门、承山、阳陵泉三穴，先后施行点、拨、揉三法，每法每穴1 min，力量为4 N。每只大鼠干预9 min，每天1次，每干预10次休息1次，共干预20次。其余组束缚同等时长。

1.4 检测方法

1.4.1 斜板测试

每组取8只大鼠，于造模前、术后7 d、28 d，在室温恒定、安静环境下进行测试。采用自制电动斜板测试仪，使用前校对并归零电子量角器。大鼠适应环境0.5 h后，将头朝向斜板远离轴端平行放置，待其适应后逐渐缓缓抬高斜板，待其发生相对位移并保持5 s后，记录此时角度。每只大鼠按次序重复测量3次，取均数。

1.4.2 Western blotting

分别于术后3 d、7 d、28 d，每组取5只大鼠，1%戊巴比妥钠3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，冰上腹主动脉取血5 ml，后取术侧坐骨神经损伤点上下各1 cm，再取脊髓L4-6节段。将组织分别放于组织裂解混合液(PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，1∶100以RⅠPA稀释)300 μl中，冰上研磨。混合液4 ℃、14 000 r/h离心1 h。吸取上清，加5×蛋白上样缓冲液并混匀。封口后100 ℃水浴5 min，后冰上5 min。BCA比色测吸光度并配平。配胶上样后稳压电泳120 V 90 min；冰上电转100 V 120 min。依据marker剪膜，使用5%脱脂奶的TBST溶液室温摇床1 h进行封闭。加一抗(NRG1抗体1∶100，ErBb2抗体1∶1000，β-actin抗体1∶3000)室温摇床孵育1 h后，4 ℃冰箱过夜。1×TBST洗膜3次，每次10 min。加二抗室温摇床孵育1 h。洗膜3次。配好显影液并避光保存，均匀滴在膜上，避光反应1 min后开始显影。

1.4.3 电镜观察

术后28 d，每组取4只大鼠，1%戊巴比妥钠3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，俯卧于冰中，快速取术侧坐骨神经损伤点上下0.5 cm，3%戊二醛溶液中固定2 h，1%锇酸溶液固定1.5 h，醋酸双氧铀染色1 h，50%～100%酒精梯度脱水，每级15 min。分别用无水酒精和无水丙酮等比例混合液、无水丙酮脱水各10 min。环氧树脂包埋，切片厚50～70 nm。铅染色，电镜观察神经损伤点，CCD数码照相系统采集图像。应用Ⅰmage J软件测量轴突直径和有髓纤维总直径，计算g-ratio。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 斜板测试

造模前，各组斜板测试角度无显著性差异(P＞0.05)。术后7 d和28 d，模型组和推拿组斜板测试角度均低于正常组和假手术组(P＜0.05)。术后28 d，推拿组评分高于模型组(P＜0.05)。正常组和假手术组在各时间点斜板测试评分比较无显著性差异(P ＞0.05)。模型组术后7 d和28 d低于造模前(P＜0.05)，推拿组术后28 d低于造模前，高于术后7 d (P＜0.05)。见表1。

2.2 Western blotting

2.2.1 坐骨神经损伤点

2.2.1.1 NRG1表达

术后3d，模型组和推拿组NRG1表达高于正常组和假手术组(P＜0.05)。术后7 d和28 d，各组NRG1表达无显著性差异(P＞0.05)。正常组在各时间点NRG1表达无显著性差异(P＞0.05)。假手术组和推拿组术后28 d NRG1表达低于术后3 d (P＜0.05)；模型组术后28 d表达低于术后3 d和7 d (P＜0.05)。见表2、图1。

2.2.1.2 ErbB2表达

术后3d和7d，模型组和推拿组ErbB2表达高于正常组和假手术组(P＜0.05)。术后28d，各组ErbB2表达无显著性差异(P＞0.05)，但推拿组ErbB2表达高于模型组(P＜0.05)。正常组和假手术组各时间点ErbB2表达无显著性差异(P＞0.05)。模型组术后28 d ErbB2表达低于术后3 d(P＜0.05)；推拿组术后7d和28dErbB2表达低于术后3d (P＜0.05)。见表3、图1。

表1 各组斜板测试角度比较(°)

表2 各组坐骨神经中NRG1平均积分光密度

2.2.2 L4-6脊髓

2.2.2.1 NRG1表达

术后3d，模型组和推拿组NRG1表达高于正常组和假手术组(P＜0.05)。术后7d，模型组和推拿组NRG1表达高于假手术组(P＜0.05)。术后28d，各组NRG1表达无显著性差异(P＞0.05)，但推拿组NRG1表达高于模型组(P＜0.05)。正常组、假手术组和推拿组在各时间点NRG1均无显著性差异(P＞0.05)。模型组术后28dNRG1表达低于术后3d和7d (P＜0.05)。见表4、图2。

2.2.2.2 ErbB2表达

术后3d和7d，模型组和推拿组ErbB2表达高于正常组和假手术组(P＜0.05)。术后28d，各组间ErbB2表达比较无显著性差异(P＞0.05)。各组组内各时间点比较也无显著性差异(P＞0.05)。见表5、图2。

2.3 电镜观察

2.3.1 形态学

术后28d，假手术组髓鞘致密均匀，结构完整，形态规则并呈板层样结构整齐排列；模型组部分髓鞘轴突可见重度髓鞘崩脱，髓鞘扭曲，偶有髓鞘球，板层间隙扩大、板层分离；推拿组髓鞘部分磷脂脱落，板层略有分离，偶见髓鞘崩脱。见图3。

2.3.2 g-ratio

术后28d，模型组g-ratio值低于假手术组(P＜0.05)，推拿组高于模型组(P＜0.05)，且与假手术组比较无显著性差异(P＞0.05)。见表6。

表3 各组坐骨神经中ErbB2平均积分光密度

表4 各组L4-6脊髓中NRG1平均积分光密度

表5 各组L4-6脊髓中ErbB2平均积分光密度

图1 术后各时间点各组坐骨神经损伤点中NRG1和ErbB2表达(Western blotting)

图2 术后各时间点各组L4-6脊髓中NRG1、ErbB2表达(Western blotting)

表6 术后28d各组g-ratio值

3 讨论

周围神经损伤主要表现为运动和感觉功能障碍、肌肉无力和肌肉萎缩，按症状可归于中医的痿证和痹证。前者以痿软无力为主，是功能异常；后者以疼痛麻木为主，是感觉异常[4]。中医论治时，以舒筋活络、扶正祛邪为要，通过口服外用中药、针灸推拿等中医干预手段，改善症状，减轻肌肉萎缩、无力及疼痛、感觉异常，最终通过促进神经恢复、减少细胞凋亡达到疗效。内治以健运脾胃、调补肝肾、养血行瘀为主[5]。外治主要采用针灸推拿，前者侧重经络理论上穴位的主治与特性，后者侧重在解剖层面消除病因，其共同点是舒筋通络、活血止痛，以期恢复正常结构与功能。

痹证中“坐臀风”(又名腿股风)症见臀部疼痛，可连累腰、腿，甚至足跟，这与坐骨神经痛症状极为相似，其治疗侧重放松局部，以膀胱经和胆经为主，点、拿、按环跳、委中、承山、阳陵泉[6]。痿证中下肢症状的选穴除上述穴位外还有心俞、命门、关元等穴。本研究根据经络和解剖理论选取殷门、承山和阳陵泉三穴，对坐骨神经钳夹损伤大鼠进行手法干预。

推拿干预在坐骨神经损伤后修复的过程中，从运动[7]和感觉[8]功能恢复两个方面起效；在脊髓、背根节、坐骨神经损伤点三个水平，多因子共同发挥作用。经推拿手法干预，在脊髓水平，脊髓腹角运动神经元损伤减轻[9]，轴突再生加快[10]；在背根节水平，可减少神经元变性及肿胀现象[11]；在坐骨神经水平，改善神经元凋亡[12]，促进神经纤维髓鞘再生与轴突恢复[13]。此外，推拿干预可以调控多种因子的表达，促进受损周围神经的恢复。细胞凋亡相关的Bcl-2、Caspase-3[7]，与轴突相关的层黏连蛋白[14]，与髓鞘相关的髓鞘碱性蛋白[15]，与神经细胞生长增殖相关的降钙素基因相关肽[16]和神经生长因子[17]，突触可塑性相关的Synapsin Ⅰ[6]，轴浆运输相关的马达蛋白(Dynein、Kinesin、Dynactin)[18]，神经元细胞骨架相关的微管相关蛋白2和神经丝蛋白[19]等因子都参与这个过程。

图3 电镜观察结果

在周围神经系统中，施万细胞包绕轴突形成髓鞘，不仅可使电信号跳跃式传导，亦有营养支持、修复受损的作用。周围神经损伤后，Wallerian变性发生，轴突和髓鞘崩解消失。g-ratio值反映髓鞘厚度，数值越大，髓鞘越薄。正常成年大鼠周围神经此比值为0.6[20]。本研究显示，术后28d，假手术组和推拿组g-ratio值与此值接近，模型组降低，说明坐骨神经损伤点处在此时间点超微结构仍显示髓鞘变厚，推拿干预可减轻髓鞘变厚程度，更趋近于正常水平。模型组结果与既往研究[21]不同，其原因可能是术后28d一部分髓鞘板层仍处于分离状态，其间隙仍扩大，亦可能是观察视野距离损伤点远近不同所致。本研究还发现，推拿干预28 d能促进模型动物患侧肢体运动功能恢复。这与本团队前期大量研究的结果相同，说明推拿干预能明显改善患侧后肢肌力，改善其运动功能。推拿治疗坐骨神经损伤疗效显著，且有确切形态学证据。

NRGs是一类细胞生长与分化调节相关蛋白，对神经系统的发育起重要作用，可分为NRG1～NRG4，其中NRG1研究最多。NRG1的表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)样结构可以结合并激活ErbB受体酪氨酸激酶家族(ErbB1～ErbB4)。ErbB2活化需要ErbB3或ErbB4的参与，形成异源性二聚体，激活下游信号分子发挥作用[22]。不同类型的NRG1作用亦不同。当神经损伤后，轴突-施万细胞相互作用中断，轴突跨膜NRG1与胶质ErbB受体的相互作用消失，可溶性NRG1转录被激活[23]。在周围神经系统中，NRG1通过与受体ErbB结合，调控施万细胞行为，调控髓鞘再生。轻度损伤(如挤压伤或切断伤)后，远端神经残端可溶性NRG1表达立即显著增加[24]。此信号可调控神经嵴细胞向施万细胞前体分化[25]，并调控后者的增殖和迁移[26]。外源性NRG1干预可防止和降低因轴突切断导致的施万细胞凋亡[27]。轴突源性的NRG1Ⅲ与施万细胞ErbB2/3受体结合发生磷酸化，产生起始信号并激活下游的丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶、磷脂酶C、蛋白激酶C等神经修复再生相关的信号通路，在髓鞘化过程中发挥作用[23]。除了神经修复作用，NRG1-ErbB信号亦在精神分裂症[28]、心肌梗死[29]等疾病中通过调控神经胶质细胞、心肌细胞发挥作用。

在坐骨神经损伤点中，模型组和推拿组术后28d NRG1、ErbB2表达低于术后3 d；造模后3 d，模型组和推拿组NRG1、ErbB2表达高于假手术组。提示此信号在神经损伤早期起效。术后7d，各组NRG1无显著性差异，而模型组和推拿组ErbB2表达升高。这说明ErbB2的高表达可能与NRG1信号无关，其原因可能是NRG1通过ErbB3或ErbB4，与ErbB2形成二聚体活化起效，因此推断在此时间点ErbB2的蛋白表达可能有一定时间延后性。术后28d，模型组和推拿组NRG1、ErbB2表达与正常组和假手术组比较均无显著性差异，提示在神经损伤后28d，坐骨神经水平的NRG1-ErbB2信号已完成其对于损伤神经的调节。干预后，推拿组NRG1、ErbB2表达高于模型组，提示推拿干预可以一定程度上提高坐骨神经中NRG1、ErbB2的表达。在不同模型和干预方法的研究中，NRG1、ErbB2亦发挥相似作用。对于糖尿病周围神经病大鼠，电针干预14 d可上调坐骨神经NRG1和ErbB2 mRNA表达，改善坐骨神经功能[30]。对于正中神经受损小鼠，人为促进ErbB2高表达，能显著改善握力，促进轴突末梢的生长[31]。

在L4-6脊髓中，模型组术后28d NRG1水平降低，与其在坐骨神经损伤点处变化趋势相同，亦说明推拿干预可以一定程度上提高脊髓中NRG1表达；各组术后3d、7d、28d比较，ErbB2水平均无显著性差异，其原因可能是NRG1与其他受体结合。造模后3d和7d，模型组和推拿组NRG1、ErbB2表达高于假手术组，提示其与神经损伤密切相关。术后28d，模型组和推拿组NRG1、ErbB2表达与假手术组比较无显著性差异，提示在坐骨神经损伤后28d，脊髓水平的NRG1-ErbB2已完成其对于损伤神经的修复作用。后续研究可细分时间和观察部位，结合感觉和运动功能的恢复进行分析。值得注意的是，推拿干预后，推拿组NRG1表达高于模型组，提示推拿干预可以提高脊髓NRG1的表达。在其他研究中也证实脊髓层面NRG1-ErbB2的作用。在脊神经结扎模型中，造模后14d脊髓背角中NRG1表达升高，与ErbB受体结合，介导星形胶质细胞活化[32]。在骨癌痛模型大鼠中，造模14d后脊髓背角内星形胶质细胞和小胶质细胞被广泛激活，阻断NRG1-ErbB2受体信号通路能有效抑制脊髓胶质细胞的表达和活化[33]。

综上所述，坐骨神经钳夹损伤后，NRG1、ErbB2在坐骨神经损伤点和L4-6脊髓中表达升高；推拿干预可改善模型大鼠的运动功能，调节坐骨神经损伤点处的髓鞘厚度，调节NRG1、ErbB2的表达量，促进受损神经的恢复。

在未来研究中，可以结合形态学、光遗传和慢病毒转染技术，研究NRG1-ErbB2通路对脊髓、背根节、坐骨神经损伤点中不同神经胶质细胞的影响和神经损伤、修复相关细胞(如巨噬细胞)的变化，以及中医干预对此通路和相关神经胶质细胞的影响；亦可过表达或减低甚至阻断此通路，对比中医干预，研究其对于内源性NRG1、ErbB2的影响。