汪俊宇，庞日朝，王文春，王美玉，向武，赵小华，张安仁

1.中国人民解放军西部战区总医院康复医学科，四川成都市 610083；2.四川大学生物治疗国家重点实验室，四川成都市 610041；3.西南财经大学天府学院，四川成都市 610052

肠道菌群数量与哺乳动物细胞之比约为10∶1，其基因组是人类基因组的1000倍[1-3]。这种巨大的微生物网络对细胞的代谢、食物的消化、营养的吸收以及免疫系统调节都至关重要[4-6]。有益的非致病性肠道细菌被致病性细菌所取代，使肠道菌群原有的稳态被破坏，表现为肠道菌群失调。肠道菌群失调可对帕金森病、多发性硬化、阿尔茨海默病、孤独症、肌萎缩侧索硬化等中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病的发生发展产生影响[7-11]。

动物实验指出[12]，脊髓损伤后肠道菌群会发生紊乱，严重降低脊髓损伤后的运动功能。小样本临床报道脊髓损伤患者肠道菌群变化特征，并发现5个菌属具有统计学意义[13]。国内张洁等[14]发现，急性创伤性脊髓损伤患者存在肠道菌群紊乱，且菌群变化与血清生化标志物的升高相关。脊髓损伤后肠道菌群紊乱可能与病情的发展以及后期的康复结局关系密切，值得深入研究。

本研究分析脊髓损伤患者肠道菌群属水平的变化特征，探讨其在临床康复中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2018年1月至12月，选取本院脊髓损伤住院患者23例(患者组)，同期体检健康受试者21例(对照组)。

诊断标准：美国脊髓损伤协会(American SpinalⅠnjury Association,ASⅠA)制定的脊髓损伤神经学分类国际标准(2013修订)[15-16]。

纳入标准：①18～60岁；②近1个月内未使用抗生素、益生菌、益生元、合生元等制剂；③无心、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病；④无严重腹泻、炎症性肠病等胃肠道疾病以及半年内未进行粪菌移植治疗；⑤无呼吸衰竭、心力衰竭、肾衰、肝衰、严重的肺感染，膀胱感染以及癌症等对患者生活质量有严重影响的疾病；⑥受试者本人或直系亲属知晓，并签署知情同意书。

排除标准：①妊娠期、哺乳期妇女；②不能够配合完成本研究。

脊髓损伤患者的一般资料见表1。纳入研究的脊髓损伤患者血液白细胞数都在正常参考范围内；绝大多数患者尿液中的白细胞数、细菌数都在正常范围内，无严重的膀胱感染现象发生，研究阶段均未使用抗生素治疗。

对照组中男性16例，女性5例，平均年龄(37.05±7.871)岁；患者组中男性18例，女性5例，平均年龄(35.87±8.275)岁，神经源性肠道功能障碍(neurogenic bowel dysfunction,NBD)评分(12.57±6.298)分。两组在性别、年龄方面无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

本研究得到中国人民解放军西部战区总医院伦理委员会批准(No.2018ky08)，并在中国临床试验中心注册(No.ChiCTR1800016823)。

1.2 方法

准备好一次性粪便容器，消毒洗手，戴一次性医用塑料手套，每个粪便收集管收集0.5～1 g样品，分装后立即盖上管盖，尽可能使样品处于相对厌氧环境。注意样品不能反复冻融。

肠道菌群检测及生物信息学分析测序步骤如下。①样品编号后立即转入-80 ℃的冰箱中保存。

②根据PowerFecal™DNA Ⅰsolation Kit试剂盒(德国QⅠAGEN公司)说明书进行粪便样品总DNA提取。

③引物合成：合成带有Barcode的特异引物16S。引物使用515F(5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') 和 806R(5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3')[17-18]。

④对样本的16S rDNA V4区域进行扩增：以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)。每一个25 μl的体系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 U KOD-Plus-Neo酶(TOYOBO)和10 ng模板。PCR程序包括起始94 ℃1 min，然后30循环(变性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s和延伸72 ℃30 s)，最后72 ℃5 min。每个样本进行3个重复，每个PCR反应终止于线性扩增期，PCR结束后将同一样本的PCR产物混合后进行电泳检测，使用胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段。

⑤HiSeq文库构建及测序：使用PowerFecal™DNA提取试剂盒对PCR扩增产物(每个样本3 μg)进行测序前准备，具体操作参照试剂盒说明。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit试剂盒建库，然后在Ⅰllumina Hiseq测序仪平台对PCR产物进行双端测序。

⑥生物信息学分析：首先对两组属水平上的组成进行分析，然后通过随机森林机器学习的方法对两组粪便样品中的肠道菌群进行比较分析。

表1 脊髓损伤患者情况

表2 两组一般资料比较

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行分析。计量资料先做正态性检验及方差齐性检验，若符合正态分布且满足方差齐性，以()表示，运用t检验；若不符合上述条件，则以M(Ql,Qu)表示，运用非参数检验(Mann-WhitneyU)。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 物种组成分析

由于属水平的物种数量较多，本部分只展示相对丰度较高的菌属。

对照组占主要地位的菌属除了Alistipes (理研菌属)、Parabacteroides (紫单胞菌属)、Megasphaera (氨基酸球菌属)、Prevotella 9 (普雷沃氏菌属9)、Escherichia-Shigella (埃希氏菌属-志贺氏菌属)、Lachnospiraceae UCG-008 (毛螺旋菌属UCG-008)、Ruminococcaceae UCG-014(瘤胃菌科UCG-014)、[Ruminococcus]torques group (瘤胃球菌属-torques group)、Enterobacter(肠杆菌属)、Roseburia(罗斯氏菌属)、Lachnospiraceae UCG-004 (毛螺旋菌属UCG-004)、Prevotella 2(普雷沃氏菌属2)、Fusobacterium (梭杆菌属)的平均相对丰度低于1%以外，Bacteroides (拟杆菌属)、Megamonas (氨基酸球菌属)、[Eubacterium]coprostan oligenes group、Ruminococcaceae UCG-002(瘤胃菌科UCG-002)、Lachnospiraceae NC2004 group (毛螺旋菌属NC2004 group)、Lachnospiraceae NK4A136 group (毛螺旋菌属NK4A136 group)、[Eubacterium]eligens group(优杆菌科)、Phascolarctobacterium (光冈菌属)等8个菌属的平均相对丰度都大于1%。

患者组除Megamonas(氨基酸球菌属)、Prevotella 9 (普雷沃氏菌属9)、[Eubacterium]eligens group(优杆菌科)、Ruminococcaceae UCG-014(瘤胃菌科UCG-014)、Enterobacter (肠杆菌属)、Roseburia (罗斯氏菌属)、Lachnospiraceae UCG-004 (毛螺旋菌属UCG-004)、Prevotella 2(普雷沃氏菌属2)、Fusobacterium(梭杆菌属)等菌属的平均相对丰度低于1%外，其余菌属的相对丰度均高于1%。见表3。

与对照组相比，患者组Escherichia-Shigella(埃希氏菌属-志贺氏菌属)、Lachnospiraceae UCG-008(毛螺旋菌属UCG-008)、Alistipes(理研菌属)、Parabacteroides(紫单胞菌属)、[Ruminococcus]torques group(瘤胃球菌属-torques group)等菌属相对丰度增高(P＜0.05)，而Fusobacterium (梭杆菌属)的平均相对丰度降低(P＜0.05)。见表3。两组间的某一些菌科差异比较明显，并且在每个样品中个体差异也比较明显。

2.2 物种差异分析

本研究分析Gini指数＞0.2的菌群，发现两组在各个分类水平都存在显著性差异(P＜0.05)。在属水平，与对照组比较，患者组中丰度升高的重要标志性菌属分别是：瘤胃菌科的UBA1819、Ruminiclostridium 9、Ruminococcaceae NK4A214 group、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae UCG-005、Ruminiclostridium 5、Flavonifractor；理研菌科的Alistipes、dgA-11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group；毛螺菌科[Eubacterium]oxidoreducens group；消化链球菌科的Ⅰntestinibacter；肠杆菌科Escherichia-Shigella (志贺菌属)；以及Tannerellaceae的Parabacteroides (P＜0.05)。患者组丰度显著降低的是梭杆菌科的Fusobacterium菌属(P＜0.05)。见图1和表4。

3 讨论

脊髓损伤后由于自主神经功能受到损害，导致患者对感染的易感性增加，免疫功能降低，心血管功能障碍甚至出现其他代谢性疾病；抑郁、焦虑等心理问题也随之出现。此外，脊髓损伤患者由于CNS受损，经常出现NBD，表现出便秘或大便失禁等症状。本组患者NBD评分结果显示不同程度的NBD。

本研究显示，属于Ruminococcaceae (瘤胃菌科)的UBA1819、Ruminiclostridium 9、Ruminococcaceae NK4A214 group、Ruminococcus 2、Ruminococcaceae UCG-005、Ruminiclostridium 5、Flavonifractor丰度为增加。推测可能与脊髓损伤患者长期处于抑郁状态相关。有研究发现[19]，脊髓损伤患者抑郁的发生率较高。近年来，诸多研究证实肠道菌群与抑郁症的发生发展密切相关，其中瘤胃菌科与抑郁存在紧密联系[20-21]。也有研究表明[22]，瘤胃球菌与CNS疾病关系密切，瘤胃球菌与神经健康的标志物N-乙酰天门冬氨酸(N-acetylaspartate,NAA)、血清5-羟色胺和皮质醇呈负相关，肠道瘤胃球菌可通过血液中的皮质醇间接影响大脑NAA。

表3 两组在主要属水平上的菌群相对丰度(%)

图1 两组属水平上的菌群差异分析

表4 两组属水平上的菌群差异统计表

同时，我们发现Rikenellaceae (理研菌科)的Alistipes、dgA-11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group等菌属是脊髓损伤组重要的标志性细菌，其中Alistipes重要性最大。Zhao等[23]的研究发现，Alistipes菌属相对丰度上升与结肠内长链饱和脂肪酸(saturated long-chain fatty acid,SLCFAs)含量增加呈正相关，SLCFAs对结肠运动具有刺激作用，SLCFAs增加可直接引起结肠运动增强，从而提高排便的频率，导致正常宿主肠功能紊乱症状的发生。虽然Alistipes菌属促进结肠运动的具体机制尚不明确，是否需要完整的中枢神经参与也不太清楚，但进一步研究该菌属对结肠的作用或许对促进脊髓损伤后的胃肠蠕动有重要的意义。

我们还发现患者组中某些肠道致病菌相对丰度增加，如属于Peptostreptococcaceae (消化链球菌科)的Ⅰntestinibacter (肠杆菌)相对丰度增加，该病原菌可引起人体组织和器官感染，如肺部、胸膜感染，颅内感染及软组织感染等。属于Enterobacteriaceae (肠杆菌科)的Escherichia-Shigella (志贺菌属)相对丰度增多。志贺菌属是肠道中的一类致病菌，可以引起急性直肠、结肠炎，临床症状表现为水样泻、黏液脓血便、里急后重，部分患者有剧烈头痛[24]。在脊髓损伤患者临床康复期间的肠道管理中，我们应该密切关注志贺菌属与消化链球菌属，积极预防各种感染以及痢疾、腹泻等肠道疾病。

此外，本研究还发现，与对照组比较，患者组产生丁酸代谢产物的梭杆菌属(Fusobacterium)显著减少。丁酸对人体健康有着积极的促进作用，具有抗炎、抗癌、增强结肠的防御功能、促进营养物质吸收等作用[25-29]。今后还要进一步研究其对丁酸含量的影响。

本研究初步分析了中国脊髓损伤患者肠道菌群属水平的特征。不足之处在于样本量较小。未来将根据不同病程、损伤程度、损伤平面对脊髓损伤患者进行亚分组分析，以更全面、充分地阐释脊髓损伤患者肠道菌群的变化特点。虽然本次研究发现某些与脊髓损伤患者临床康复关系密切的肠道菌属，但还需要通过基础研究来进一步寻求证据。密切关注脊髓损伤后的肠道菌群变化，对提高脊髓损伤患者免疫功能、生活质量，减少并发症，促进全面康复，或许有一定的临床价值。