陈嘉鑫,冯建国,贾 静,刘 行,王晓斌

(西南医科大学附属第一医院麻醉科,泸州 646000;*通讯作者,E-mail:wang-xiaobin67@163.com)

传统抗抑郁药物起效慢,一般在开始治疗数周后才显现明显的治疗效果[1-3],因此,临床上迫切需要开发快速、有效的抗抑郁新药。相关基础和临床研究均表明氯胺酮具有快速而明显的抗抑郁作用[4-6],但其机制不清楚,阐明其快速抗抑郁机制,对今后开发快速起效的抗抑郁新药具有重要意义。

18F-脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(18F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography,18F-FDG PET)研究发现,抑郁症大鼠相关脑区葡萄糖代谢率明显低于正常大鼠[7]。与健康志愿者相比,抑郁症患者的局部脑葡萄糖代谢率(regional cerebral metabolic rate of glucose,rCMRglu)也明显降低[8,9]。有趣的是,Mishra等[10]发现氯胺酮在快速缓解抑郁症大鼠抑郁症状的同时,还伴随神经元和星形胶质细胞葡萄糖代谢的增加,然而氯胺酮通过什么途径增加脑葡萄糖代谢,进而发挥快速抗抑郁作用尚不清楚。

星形胶质细胞是数量最多、作用最广泛的胶质细胞[11],是整个中枢神经系统的组成部分,并发挥许多复杂的功能[12]。星形胶质细胞周围包裹着大脑的微血管,且分布着大量葡萄糖转运体(glucose transporters,GLUTs)[13]。葡萄糖是神经元和胶质细胞的主要能量底物,星形胶质细胞膜上的葡萄糖转运体负责葡萄糖的吸收[14]。因此,本研究主要探讨氯胺酮对星形胶质细胞葡萄糖吸收、GLUTs、相关信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂

DMEM细胞培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、GLUT1、磷酸化AMPK、总ERK1/2、磷酸化ERK1/2抗体及BCA蛋白定量试剂盒购自中国碧云天公司;GLUT3及GLUT4抗体购自美国Santa Cruz公司;磷酸化AKT及总AKT购自美国Cell Signaling公司;GAPDH,β-actin抗体、羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗购自中国Proteintech公司。

1.2 细胞培养

人正常星形胶质细胞株(HA1800)购自中国博士德生物公司；细胞在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、以及100 μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中贴壁生长，细胞培养箱环境维持在37 ℃、5% CO2条件。

1.3 葡萄糖吸收检测

荧光D-葡萄糖同系物2-(N-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG)(购自美国APExBIO公司)用于细胞葡萄糖吸收检测。HA1800细胞接种在24孔板中,待细胞汇合度达到50%时,进行如下处理:①将细胞分为对照组(0 h)、50 μmol/L氯胺酮组分别处理0.5,3,6,12,24 h;②将细胞分为对照组(0 μmol/L),氯胺酮组分别用10,25,50,100,200 μmol/L的氯胺酮处理6 h。待上述作用结束后,再用100 μmol/L 2-NBDG在37 ℃培养箱内孵育20 min。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次终止2-NBDG继续吸收,用4%多聚甲醛固定20 min后,再用PBS洗3次后立即用荧光显微镜观察(购自美国Bio-Tek公司)。利用ImageJ软件对荧光进行分析。

1.4 Western blot检测GLUTs以及ERK1/2、AKT、AMPK信号通路蛋白表达

HA1800细胞接种于10 cm培养皿中,在37 ℃培养箱中孵育24 h,将细胞分为对照组(0 μmol/L),氯胺酮组分别用10,25,50,100 μmol/L的氯胺酮处理6 h,上述作用结束后,用PBS洗涤细胞3次后加入RIPA细胞裂解液(按1 ∶100加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂),放置冰上裂解细胞。蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒测定。将每组样本的细胞总蛋白等量进行SDS-PAGE电泳后恒流转膜1 h,转印后的NC膜用5%的脱脂牛奶封闭1 h,TBST洗涤3次后,分别用GLUT1(1 ∶500)、GLUT3(1 ∶100)、GLUT4(1 ∶200)、t-ERK1/2(1 ∶1 000)、p-ERK1/2(1 ∶1 000)、t-AKT(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶1 000)、p-AMPK(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶2 500)、β-actin(1 ∶5 000)的第一抗体在4 ℃孵育NC膜过夜。第2天重复洗涤后,分别用羊抗鼠二抗(1 ∶2 500)或羊抗兔二抗(1 ∶5 000)孵育1 h,在NC膜上加入ECL显色剂后检测目标蛋白变化。利用ImageJ软件对条带灰度进行分析。

1.5 细胞免疫荧光

免疫荧光用于检测p-ERK1/2在星形胶质细胞中的亚细胞定位。HA1800接种于24孔板中并在37 ℃培养箱中过夜。将细胞分为对照组(0 μmol/L)、氯胺酮组用50 μmol/L氯胺酮处理,作用6 h后立即用4%多聚甲醛固定20 min,再用PBS洗涤细胞3次。用1%胎牛血清蛋白在室温下封闭1 h,孵育p-ERK1/2(1 ∶1 000)一抗在4 ℃摇床过夜。第二天用PBS洗涤细胞3次后,在室温下避光孵育羊抗鼠(1 ∶2 500)二抗及细胞核染料DAPI,用抗荧光猝灭剂封片后立即于荧光显微镜下观察。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 氯胺酮增加HA1800细胞葡萄糖吸收

葡萄糖吸收检测显示,与0 h相比,50 μmol/L氯胺酮在6 h时2-NBDG吸收差异具有统计学意义(P=0.018,见图1)。与0 μmol/L相比,25,50,100 μmol/L浓度的氯胺酮作用6 h后2-NBDG摄取差异具有统计学意义(P分别为0.003 3,0.000 1,0.007 4,见图2)。氯胺酮对2-NBDG吸收的促进作用在50 μmol/L浓度时到达高峰,然而当浓度≥200 μmol/L以及≤10 μmol/L时对2-NBDG摄取的增加具有限制作用(P分别为0.792 8,0.140 6,见图2)。

与0 h比较,*P<0.05图1 50 μmol/L氯胺酮作用不同时间对星形胶质细胞葡萄糖吸收的影响Figure 1 Effect of 50 μmol/L ketamine on glucose uptake in astrocytes at different time points

与0 μmol/L比较,**P<0.01,***P<0.001图2 不同浓度氯胺酮作用6 h对星形胶质细胞葡萄糖吸收的影响Figure 2 Effect of different concentrations of ketamine for 6 h on glucose uptake in astrocytes

2.2 氯胺酮增加HA1800细胞GLUT3表达

经不同浓度氯胺酮处理6 h后,One-way ANOVA检测发现只有GLUT3响应氯胺酮的刺激(F4,10=3.610,P=0.045 4),其中与0 μmol/L组相比,只有50 μmol/L氯胺酮组的GLUT3表达差异具有统计学意义(P=0.014,见图3)。

与0 μmol/L比较,*P<0.05图3 氯胺酮对GLUT1、3、4表达的影响Figure 3 The effect of ketamine on the expression of GLUT 1, 3, 4 in HA1800 cells

2.3 氯胺酮增加HA1800细胞内磷酸化ERK1/2表达水平

one-way ANOVA检测发现不同浓度氯胺酮作用6 h后,p-ERK1/2表达差异具有统计学意义(F4,10=5.598,P=0.012 5),与0 μmol/L相比,50 μmol/L氯胺酮处理后p-ERK1/2表达差异具有统计学意义(P=0.006 9,见图4)。然而与0 μmol/L相比,p-AKT以及p-AMPK表达差异无统计学意义(P>0.05,见图4)。

与0 μmol/L比较,**P<0.01图4 氯胺酮对p-ERK1/2、p-AKT以及p-AMPK表达的影响Figure 4 The effect of ketamine on the expression of phospho-ERK1/2, phospho-AKT, and phospho-AMPK

2.4 氯胺酮调节磷酸化ERK1/2细胞内亚定位

与对照组(0 μmol/L)比较,免疫荧光检测显示经50 μmol/L氯胺酮作用6 h后,p-ERK1/2由HA1800细胞质转移至细胞核内,聚集明显(见图5)。

图5 氯胺酮调节P-ERK1/2亚细胞定位Figure 5 The effect of ketamine on subcellular location of phospho-ERK1/2

3 讨论

氯胺酮具有快速而明显的抗抑郁作用,但其抗抑郁机制尚不清楚[15,16]。有研究发现氯胺酮抗抑郁的同时伴随脑内葡萄糖代谢率(CMRGlc)升高[10],因此我们猜测CMRGlc升高可能是由于脑内葡萄糖摄取增加所致。由于星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥着许多重要且复杂的功能[12],且星形胶质细胞及其相关标志物的减少是抑郁症病理学变化的关键特征[17,18],因此本实验观察了不同浓度氯胺酮对人来源的正常星形胶质细胞(HA1800)葡萄糖摄取的影响。我们的研究结果表明50 μmol/L氯胺酮(相当于临床亚麻醉剂量[19])作用6 h可显著增强星形胶质细胞葡萄糖吸收。但氯胺酮通过什么途径诱导星形胶质细胞葡萄糖摄取增加尚不清楚。

相关研究表明葡萄糖转运蛋白(GLUTs)在星形胶质细胞葡萄糖摄取增加中发挥关键作用[20],由于GLUT1、3、4在大脑葡萄糖转运中发挥重要作用[21],因此我们检测了GLUT1、3、4蛋白在HA1800细胞内的表达。在生理条件下,培养的星形胶质细胞主要表达GLUT1,而GLUT3的表达水平相对较低,但在轻度缺血[22]、内毒素脂多糖(LPS)[23]等应激条件下GLUT3表达明显增加。GLUT4是一种胰岛素依赖的葡萄糖转运蛋白,其调控机制与GLUT1或GLUT3的机制不同[24]。因此,本研究进一步检测了氯胺酮对HA1800细胞GLUT1、GLUT3和GLUT4的表达,结果表明氯胺酮诱导HA1800细胞葡萄糖吸收增加是通过GLUT3而非GLUT1或GLUT4。由于GLUT3转运细胞外葡萄糖进入细胞内的速度大约是GLUT1的7倍[25],所以我们认为氯胺酮处理后HA1800细胞GLUT3表达增强是可以解释的。我们的结果与Tomioka等[26]发现氯胺酮通过对爪蟾卵母细胞GLUT3表达增加从而提高葡萄糖摄取的研究一致,此外,Iasevoli等[27]也发现氯胺酮可诱导大鼠GLUT3 mRNA的表达增加。但目前尚不清楚哪些信号通路与氯胺酮诱导星形胶质细胞GLUT3表达增加有关。

有研究表明激活ERK1/2,AKT和AMPK信号通路能促进星形胶质细胞葡萄糖摄取[28,29]。我们的结果表明,氯胺酮处理星形胶质细胞后只增加了p-ERK1/2的表达,而不影响p-AKT和p-AMPK的表达水平,免疫荧光染色实验也显示氯胺酮可以诱导p-ERK1/2从细胞质易位进入到细胞核内,进而产生诱导增殖、分化等生理过程[30,31],但p-ERK1/2进入细胞核内是否进一步调控了GLUT3的表达,需在今后研究中进一步明确。

我们的研究证明氯胺酮可增加星形胶质细胞对葡萄糖的摄取,但尚不清楚进入细胞内的葡萄糖参与怎样的代谢过程。Pellerin等[32]认为星形胶质细胞通过糖酵解将葡萄糖转化为能量底物乳酸,再传送给周围神经元提供能量,即星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭模型(astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis,ANLS)。但氯胺酮是否可致星形胶质细胞释放乳酸,以及乳酸后续是否为神经元提供能量,尚需在今后研究中进一步证实。

综上所述,我们的研究结果表明氯胺酮通过ERK1/2信号通路增加GLUT3表达,从而促进星形胶质细胞对葡萄糖的摄取。