吕成鹏,倪 华,马 锐,李 龙,刘 斌,刘彦普

(1陕西省人民医院口腔科,西安 710068;2空军军医大学口腔医院口腔颌面外科;3空军军医大学口腔医院组织工程研发中心;4陕西省西安市儿童医院麻醉科;5广东省深圳市南山区蛇口人民医院口腔科;6空军军医大学口腔医院动物实验中心;*通讯作者,E-mail:liuyanpu@fmmu.edu.cn)

脂肪移植后的吸收一直是困扰口腔颌面外科和整形科的问题,由于脂肪吸收的不确定性,对于自体脂肪移植通常需要多次注射和超量注射来平衡脂肪吸收所带来的问题[1]。随着组织工程技术的发展,软组织修复重建迎来新的希望。本课题组的前期研究发现,采用脂肪基质干细胞(ADSCs)复合移植脂肪组织能够降低脂肪移植后的吸收率[2],但对于ADSCs在脂肪移植后的组织分布缺乏研究。CM-DiI是一种羰花青荧光染料,能与细胞膜结合,发出强大的红色荧光,细胞毒性极低,尤其适合标记和示踪干细胞[3]。本研究拟探讨CM-DiI对ADSCs的体外标记,并观察标记后的干细胞在脂肪移植组织中的分布与转归。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

高糖DMEM(Gibco,USA),胎牛血清(Gibco,USA),I型胶原酶(Sigma,USA),β-甘油磷酸钠(Sigma,USA),3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)(Peprotech,USA),吲哚美辛(Peprotech,USA),茜素红(Peprotech,USA),小鼠抗兔CD29-IgG抗体(Abcam,USA),小鼠抗兔CD31-IgG抗体(Abcam,USA),羊抗小鼠IgG FITC(Abcam,USA),CM-DiI(Invitrogen,USA),Hoechst(Thermo,USA)。

1.2 实验动物

6月龄雄性新西兰大白兔3只,体质量2.5-3 kg,6周龄雌性BALB/c裸鼠6只,约30 g,中科院上海实验动物中心提供,空军军医大学实验动物中心SPF环境下饲养。

1.3 ADSCs的分离和培养

取新西兰兔双侧腹股沟及颈背部的皮下脂肪,清理并剔除其内的结蹄组织,剪碎切取的脂肪组织,用DMEM高糖配制1% Ⅰ型胶原酶37 ℃消化1 h;1 000 r/min离心5 min,弃上清。加入DMEM培养基(含青霉素和链霉素,10%胎牛血清,292 mg/L的谷氨酰胺,50 mg/L的维生素C)重悬;接种于25 cm2培养瓶中,5%CO2,37 ℃饱和湿度培养,培养3 d换液,后隔日换液;5-7 d按照1 ∶2比例传代,第二代细胞以1 ∶3传代。

1.4 ADSCs的成脂、成骨多向分化能力检测

成脂分化能力检测:取第3代的ADSCs细胞,1×105/cm2接种于1.2 cm×1.2 cm的盖玻片上,加入DMEM培养基,细胞密度达80%后加入成脂诱导培养基,3 d换液1次,接种7 d用4%的多聚甲醛固定15 min,PBS洗3次,60%异丙醇淋洗。浸入油红O染液10 min,60%异丙醇分色至背景无色,双蒸水洗1次,苏木精复染,晾干,甘油明胶封片,镜检。

成骨分化能力检测:取第3代的ADSCs细胞,1×105/cm2接种于1.2 cm×1.2 cm的盖玻片上,加入DMEM培养基,细胞密度达80%以后加入成骨诱导培养基,每3 d换1次液,4周后用4%的多聚甲醛固定15 min,PBS洗3次,加1%茜素红溶液,37 ℃染色30 min,双蒸水洗去多余的染料,晾干,甘油明胶封片,镜检。

成脂诱导培养基：高糖DMEM 10%；胎牛血清;1 μmol/L地塞米松；10 μmol/L胰岛素；0.5 mmol/L IBMX；200 μmol/L吲哚美辛；1%双抗。成骨诱导培养基：高糖DMEM；5%胎牛血清；0.1 μmol/L地塞米松；50 mg/L维生素C；10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠；1%双抗。

1.5 流式细胞仪检测ADSCs表面标记物

取第3代ADSCs细胞,培养密度达到80%后,消化并进行CD29和CD31免疫组化染色,通过流式细胞仪检测其阳性率。取1×106个细胞,PBS洗2次,加入一抗孵育30 min,离心后,弃上清,PBS洗2次,加入FITC标记羊抗小鼠二抗孵育30 min,PBS洗2次,流式细胞仪检测;对照组未加入一抗。

1.6 CM-DiI标记ADSCs及体外观测

第3代ADSCs细胞消化后,PBS洗2次,3 min/次。用不含胎牛血清的DMEM重悬细胞,加入CM-DiI使其终浓度为1 μg/ml,37 ℃孵育5 min,4 ℃孵育15 min。800 r/min,离心5 min,弃上清,PBS漂洗2次。加入新鲜培养基重悬,接种于盖玻片。待细胞贴壁后,用Carnoy固定液固定,PBS漂洗5 min,加入Hoechst工作液,室温15 min,PBS漂洗3次,5 min/次。封片,荧光显微镜下观察。

1.7 脂肪移植裸鼠模型的建立及冰冻切片的制备

3%戊巴比妥钠1 ml/kg兔耳缘静脉注射,待麻醉后,固定、消毒、铺巾。切取新西兰兔颈背部的皮下脂肪,放入无菌培养皿中,PBS冲洗2次,修剪去除多余的血管及纤维结蹄组织,剪碎脂肪组织。将剪碎的脂肪颗粒与CM-DiI标记的ADSCs混合制备脂肪移植混合物。

取1 ml针管配18号白色针头吸取脂肪移植物;在裸鼠背部皮下利用针头潜行分离,注射脂肪复合体0.3 ml(ADSCs为3×105个)。

裸鼠脂肪移植4周,颈椎脱臼法处死裸鼠,取新鲜脂肪移植物,于制冷切片机上立即冰冻切片,切片厚度为5-10 μm,荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 ADSCs的体外培养及多向诱导能力检测

ADSCs经过原代培养8 h开始贴壁,24 h完全贴壁,72 h更换培养液,生长细胞呈多角形、短梭形(见图1A),传代后逐渐变成均质的长梭形细胞(见图1B)。取第3代的ADSCs细胞进行成脂肪、成骨诱导。加入成脂诱导液后,细胞开始变为多角形,加入成脂诱导液3 d细胞内可见较小的脂滴形成,7 d时脂滴变大。油红O染色见脂肪滴染色呈红色阳性(见图1C)。加入成骨诱导液后3 d,细胞逐渐变成短梭形,加入成骨诱导液4周茜素红染色阳性(见图1D)。

2.2 ADSCs标志物的流式细胞仪检测

ADSCs的CD29表达阳性细胞比例为84.52%±4.91%,CD31表达阳性细胞比例为2.13%±0.95%,对照组均为阴性(见图2)。

图2 ADSCs标志物的流式细胞仪检测Figure 2 Flow cytometry detection of CD29 and CD31 in ADSCs

2.3 荧光显微镜所见CM-DiI标记的ADSCs

荧光显微镜下观察,视野中ADSCs胞浆为红色荧光,细胞核经Hoechst染色呈蓝色荧光(见图3)。

2.4 ADSCs在脂肪移植组织内的分布

脂肪移植组织行冰冻切片,直接显微镜下观察,可见脂肪细胞空腔样结构;在荧光显微镜下观察发现,ADSCs红色荧光在脂肪移植组织中表达阳性,且红色荧光分布符合脂肪组织结构呈多孔样(见图4),提示ADSCs可能分化为脂肪细胞。

A.Hoechst染细胞核(蓝色);B.CM-DiI标记的ADSCs,主要位于胞膜和胞质中(红色);C.合成图像(×200)图3 CM-DiI标记的第3代ADSCsFigure 3 CM-DiI labeling of the third generation ADSCs

A.冰冻切片直接显微镜下观察;B.CM-DiI标记的细胞;C.合成图(×50)图4 脂肪移植4周后ADSCs在脂肪移植物的示踪Figure 4 Distribution of ADSCs in fat graft tissues at 4 week after transplantation using fluorescence microscopy

3 讨论

关于干细胞移植示踪标记的方法主要有核酸标记法(BrdU)、基因标记(GFP)、Y染色体标记、磁标记、荧光染料标记(CM-DiI、PKH-26)等[4]。BrdU、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)能标记细胞核的DNA,标记效率较高,但随着细胞分裂次数增加,标记物会逐渐减弱消失;基因标记法程序繁琐、实验周期较长。CM-DiI是一种亲脂性的荧光染料,能够与蛋白质的硫氢基相结合,通过胞饮作用进入细胞质,从而标记整个细胞。CM-DiI荧光激发波长为553 nm,激发后可发出波长为570 nm的红色荧光。CM-DiI广泛用于各种干细胞的标记[5,6]。研究表明,利用CM-DiI标记骨髓基质干细胞(BMSCs)能够在体内示踪长达6个月之久[7];Reichenberger等[8]利用CM-DiI标记ADSCs证实ADSCs参与神经损伤后的修复。

脂肪移植后的吸收常导致医生对脂肪移植后软组织恢复情况缺乏稳定的预期[9]。如何减少脂肪移植后的吸收是需要解决的问题。随着组织工程的发展,各种干细胞被用于组织修复重建[10-12]。脂肪基质干细胞主要存在于脂肪组织中,具有强大的增殖能力和多向分化潜能,在适宜的条件下,ADSCs可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞及内皮细胞等多种细胞[13]。脂肪基质干细胞(ADSCs)由于获取容易、创伤小、数量多等优势[14]被广泛应用于缺血心肌的修复[15]、神经损伤修复[16]、软组织修复重建[17]等方面。本课题组研究发现,通过ADSCs能够减少脂肪移植后的吸收,促进脂肪移植组织的修复[2],但内在机制缺乏进一步的研究。

本实验通过贴壁原代培养法获得脂肪基质干细胞,对脂肪基质干细胞进行成脂、成骨诱导,通过油红O染色和茜素红染色证实其多向分化能力。流式细胞仪显示ADSCs的CD29表达阳性率为84.52%±4.91%,CD31表达阳性率为2.13%±0.95%,证实了ADSCs的特异性。通过CM-DiI对第3代ADSCs进行标记,荧光显微镜观察显示标记的ADSCs细胞胞质呈红色荧光,Hoechst标记的细胞核呈蓝色荧光,CM-DiI能够体外标记ADSCs。将体外标记的ADSCs移植入裸鼠模型,移植后4周在移植脂肪组织的冰冻切片中观察到红色荧光,并且红色荧光分布呈脂肪组织多孔样,进一步证实ADSCs参与脂肪移植后的组织修复,ADSCs可能分化为脂肪细胞。推测ADSCs的多向分化能力促进了脂肪移植后的修复,减少了脂肪移植后的吸收。