王 斌,肖 何,张志敏,罗 佳,金 丰,王 阁,宋 扬

(陆军军医大学大坪医院肿瘤中心,重庆 400042;*通讯作者,E-mail:songyang84zhu@163.com)

膀胱癌是世界范围内最常见的泌尿系统肿瘤,主要以手术切除和化疗等治疗方式为主,由于膀胱癌具有高复发、高转移的临床特点,多数患者的预后并不理想[1]。随着人口老龄化,膀胱癌的发病率有逐年上升的趋势[2]。探究膀胱癌发病机制,寻找新的生物标志物和分子治疗靶点,一直是膀胱癌研究领域的重要方向。长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是一类非编码、内源性的小分子RNA,长度大于200个核苷酸[3]。lncRNA可通过影响启动子的转录、mRNA稳定性和mRNA翻译效率等多种方式调控基因的表达[4]。近年的研究表明,lncRNA在肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和血管形成等多种病理过程中发挥重要的调控作用[5]。lncRNA的表达改变和其生物学功能是近年来肿瘤包括膀胱癌研究领域的新方向。最新的研究表明,LINC00665在胃癌、肺癌、肝癌等肿瘤进展过程中发挥重要的调控作用[6-8]。LINC00665在膀胱癌中的表达和生物学功能尚不明确。本研究首先检测LINC00665在膀胱癌细胞株中的表达,通过在表达量最高的膀胱癌细胞中干扰LINC00665的表达,研究LINC00665对膀胱癌细胞侵袭和增殖能力的影响和作用机制,为膀胱癌的靶向治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

膀胱癌细胞株(T24、BIU-87、5637、UM-UC-3、J82)和正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)购于上海信然生物技术有限公司;RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司;阴性对照慢病毒、携带LINC00665抑制序列(si-LINC00665正义链:5′-AAUAGCCCAA GACUGAGGACUCACA-3′,反义链:3′-UGUGAGUCCUCAGUCUUGGGCUAUU-5′)的慢病毒购于上海吉玛生物科技有限公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购于美国Sigma公司;基质胶购于美国Life Technologies公司;Transwell小室购于美国Corning公司;逆转录试剂盒和实时定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒购于日本TaKaRa公司;Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司;超敏ECL发光试剂盒购于美国Thermo公司;一抗p-P13K、p-AKT、p-mTOR、S100A13、GAPDH购于美国Abcam公司;二抗(羊抗兔)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养和感染

T24、BIU-87、5637、J82细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养,UM-UC-3、SV-HUC-1细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,培养条件为37 ℃、5% CO2,隔天换液。接种对数生长期UM-UC-3细胞至6孔板,当细胞汇合度达到70%时进行慢病毒感染,分别感染携带LINC00665抑制序列的慢病毒和阴性对照慢病毒,定义为实验组和对照组。感染复数均为40,实验步骤严格按照慢病毒感染说明书操作。观察细胞状态,更换新鲜培养基。

1.3 qPCR检测LINC00665和S100A13 mRNA的表达量

采用Trizol试剂盒提取膀胱癌细胞株和正常膀胱上皮细胞总RNA,整个提取过程处于无RN酶的环境中。采用qPCR试剂盒检测LINC00665和S100A13 mRNA的相对表达量,以GAPDH作内参。LINC00665上游引物:5′-GGTGCAAAGTGGGAAGTGTG-3′,下游引物:5′-CGGTGGACGGATGAGAAACG-3′;S100A13上游引物:5′-GATAGCCTCAGCGTCAACGAG-3′,下游引物:5′-CCTGATTCACATCCAAGCTCTT-3′;GAPDH上游引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。qPCR反应条件:初始95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,62 ℃退火25 s,72 ℃延伸25 s,共40个循环。所得数据采用2-ΔΔCt计算LINC00665和S100A13的表达量。

1.4 Transwell侵袭实验检测感染UM-UC-3细胞的侵袭能力

将处于对数生长期的两组UM-UC-3细胞消化后,采用无血清的DMEM培养基重悬并调整细胞密度,每组分别加入200 μl细胞悬液至预铺基质胶的Transwell上室,加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基至Transwell下室。在培养箱中培养24 h,取出Transwell上室,利用棉签轻轻擦去多余基质胶和未穿过底膜的细胞。利用4%多聚甲醛在室温下固定20 min,利用0.1%结晶紫染液在室温下染色20 min。流水冲洗并晾干,光镜下计数每组侵袭的细胞数,代表UM-UC-3细胞的侵袭能力。

1.5 MTT法检测感染UM-UC-3细胞的增殖能力

将处于对数生长期的两组UM-UC-3细胞消化,采用DMEM培养基重悬并调整细胞密度,以3 000个/孔接种于96孔板。分别于接种后第1-5天行MTT实验。检测时,每孔加20 μl 5 g/L MTT试剂,继续培养4 h。弃上清,每孔加130 μl二甲基亚砜并振荡,酶标仪检测吸光度(A495)值。

1.6 Western blot检测蛋白的表达

将处于对数生长期的两组UM-UC-3细胞采用蛋白裂解液提取细胞总蛋白,每组以相同的蛋白上样量行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后在5%脱脂牛奶中封闭。孵育一抗S100A13(稀释比为1 ∶2 000)、p-P13K(稀释比为1 ∶1 000)、p-AKT(稀释比为1 ∶2 000)、p-mTOR(稀释比为1 ∶2 000)和GAPDH一抗(稀释比均为1 ∶3 000),4 ℃下过夜。在室温下孵育二抗(稀释比为1 ∶10 000)3 h。漂洗后,在膜上均匀滴加超敏ECL发光试剂,凝胶成像系统中曝光、显影。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 膀胱癌细胞株中LINC00665的表达

qPCR结果显示,膀胱癌细胞株(T24、BIU-87、5637、UM-UC-3、J82)和正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)中LINC00665的相对表达量分别为4.14±0.31,3.05±0.36,1.77±0.15,6.65±0.40,5.00±0.32和1.01±0.09,膀胱癌细胞株中LINC00665的相对表达量明显高于正常膀胱细胞(P<0.05),UM-UC-3细胞中的表达最高(P<0.01,见图1)。

与SV-HUC-1细胞比较,*P<0.05,**P<0.01图1 膀胱癌细胞和正常膀胱上皮细胞中LINC00665的相对表达量Figure 1 Expression of LINC00665 in bladder cancer cells and normal bladder epithelial cell

2.2 UM-UC-3细胞感染携带LINC00665抑制序列慢病毒的效率

qPCR结果显示,对照组和实验组UM-UC-3细胞中LINC00665的相对表达量分别为1.02±0.06和0.20±0.05,实验组LINC00665的相对表达量是对照组的19.61%,差异有统计学意义(t=9.72,P<0.01,见图2)。

与对照组比较,**P<0.01图2 对照组和实验组UM-UC-3细胞中LINC00665的相对表达量Figure 2 Expression of LINC00665 in UM-UC-3 cells in control group and experimental group

2.3 低表达LINC00665对UM-UC-3细胞侵袭能力的影响

对照组和实验组细胞中穿膜UM-UC-3细胞数分别为(83.90±6.28)个和(33.78±5.27)个。与对照组比较,实验组穿膜UM-UC-3细胞数明显较少,差异有统计学意义(t=6.11,P<0.01),低表达LINC00665具有抑制膀胱癌UM-UC-3细胞侵袭的能力(见图3)。

2.4 低表达LINC00665对UM-UC-3细胞增殖能力的影响

MTT法结果显示,实验组UM-UC-3细胞在感染后第3,4,5天的A值均低于对照组,差异均有统计学意义(第3天:t=3.03,P<0.05;第4天:t=4.23,P<0.05;第5天:t=5.39,P<0.01,见图4),表明低表达LINC00665具有抑制膀胱癌UM-UC-3细胞增殖的能力。在第1,2天的A值差异无统计学意义(t分别为0.38,2.66,均P>0.05)。

2.5 低表达对LINC00665对S100A13 mRNA表达的影响

qPCR结果显示,低表达LINC00665后的实验组UM-UC-3细胞中S100A13 mRNA的相对表达量明显低于对照组,差异有统计学意义(0.28±0.05vs1.02±0.12,t=5.73,P<0.01),表明低表达LINC00665可有效降低S100A13 mRNA的相对表达。

2.6 S100A13和P13K/AKT/mTOR信号通路蛋白的表达水平

Western blot结果表明,实验组UM-UC-3细胞中,S100A13蛋白表达降低,P13K/AKT/mTOR信号通路蛋白p-P13K、p-AKT、p-mTOR表达明显降低(见图5),表明P13K/AKT/mTOR信号通路被抑制。

与对照组相比,**P<0.01图3 低表达LINC00665对UM-UC-3细胞侵袭能力的影响Figure 3 Effect of down-regulated LINC00665 on the invasion ability of UM-UC-3 cells

与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01图4 低表达LINC00665对UM-UC-3细胞增殖能力的影响Figure 4 Effect of down-regulated LINC00665 on the proliferation of UM-UC-3 cells

图5 低表达LINC00665对S100A13蛋白和P13K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达的影响Figure 5 Effect of down-regulated LINC00665 on the expression of S100A13 protein and P13K/AKT/mTOR signaling pathway proteins

3 讨论

近年来,随着分子生物学技术的发展,靶向治疗已成为膀胱癌重要的辅助治疗方式[9]。寻找有效的膀胱癌分子治疗靶点对改善膀胱癌患者的预后具有重要的临床意义。越来越多的研究显示,lncRNA在肿瘤组织中存在显著的异常表达,广泛参与调控肿瘤细胞的分化、增殖、侵袭、凋亡等活动,其异常表达与患者的临床分期、分级及预后明显相关[10]。lncRNA如CASC15、LINC00978、GClnc1在膀胱癌组织呈高表达,通过多种方式显著促进膀胱癌细胞的生长和转移[11-13]。LINC00665是一种新明确的lncRNA,其在肿瘤的发生、发展中均具有调控作用。Qi等[14]的研究表明,LINC00665在胃癌组织和细胞系中的表达明显升高,与患者TNM分期、组织学分级及预后不良有关。抑制LINC00665的表达可显著降低胃癌细胞的增殖活力和侵袭能力。Shan等[6]研究显示,在肝癌组织和细胞中LINC00665的表达升高,LINC00665表达水平越高的肝癌患者的总生存期越短,干扰LINC00665的表达可抑制细胞增殖活力并诱导细胞凋亡和自噬。LINC00665在肿瘤的发生、发展中发挥癌基因的作用。LINC00665对膀胱癌细胞生物学行为的影响未见报道。

本研究中,通过qPCR法检测LINC00665在膀胱癌细胞株中的表达,相比正常膀胱上皮,LINC00665在膀胱癌细胞株中的表达明显升高,LINC00665可能在膀胱癌发生、发展中发挥癌基因作用。本研究通过将携带LINC00665抑制序列的慢病毒感染膀胱癌UM-UC-3细胞,抑制LINC00665的表达,结果进一步表明,低表达LINC00665可明显抑制膀胱癌UM-UC-3细胞的侵袭能力和增殖能力,表明LINC00665在膀胱癌的生长过程中可能具有促进作用。钙结合蛋白A13(calcium binding protein A13,S100A13)基因定位于人类染色体1q21,包含4个外显子和3个内含子,S100A13蛋白属于S100蛋白家族成员,由98个氨基酸构成[15]。S100A13蛋白在人体多种组织中均可表达,主要通过影响细胞非经典跨膜转运通路调控细胞因子的跨膜运动,在组织修复、血管生成、肿瘤生长等多种生理、病理过程中具有重要作用[16]。S100A13在多种肿瘤组织中异常高表达,具有促进肿瘤生长和转移的作用,与患者的不良预后相关[17]。qPCR和Western blot显示,低表达LINC00665后,S100A13基因在mRNA和蛋白水平的表达明显降低。P13K/AKT/mTOR信号通路是肿瘤细胞的生长和转移的重要作用机制,具有明显的促进肿瘤发生、发展的作用[18]。P13K/AKT/mTOR信号通路蛋白如p-P13K、p-AKT、p-mTOR表达明显降低,表明P13K/AKT/mTOR信号通路被抑制。LINC00665调控S100A13基因表达的确切机制尚不明确,有待深入研究。

综上所述,相较于正常膀胱上皮细胞,膀胱癌细胞株LINC00665的表达明显升高,低表达LINC00665可明显抑制膀胱癌细胞的侵袭和增殖能力,其作用机制是LINC00665表达水平降低后,S100A13基因表达降低,进而抑制P13K/AKT/mTOR信号通路的活化。LINC00665在膀胱癌中发挥“癌基因”功能,有望成为膀胱癌治疗潜在的靶点。