任松洁,吕 娟,李 婧,王赞宏*

(1山西医科大学附属白求恩医院妇产科,太原 030032;2山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司总医院妇产科;*通讯作者,E-mail:wangzanhong@126.com)

子宫颈癌是影响全球女性健康的第二大恶性肿瘤,目前已经明确高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染与宫颈癌有着十分密切的关系,宫颈癌HPV的检出率高达99.7%,其中HPV16、18是其主要亚型,主要通过癌蛋白E5、E6、E7发挥致癌作用[1]。但事实上并非所有HPV感染的患者均有宫颈癌的发生,提示必然存在其他因素也参与了这一过程[2]。人体具有天然的抗病毒感染屏障,近来研究发现,内质网应激反应在病毒感染和致病过程中具有重要意义[3,4]。当HPV感染人体后,会产生多种病毒蛋白,在这样的情况下错误折叠或未折叠蛋白质就会在内质网内聚集,导致内质网生理功能紊乱,即内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),如果这一过程持续存在会导致细胞凋亡[5]。但是,肿瘤细胞此时会通过蛋白降解将这些错误折叠或未折叠蛋白质清除,从而使内质网功能修复避免死亡。蛋白质的降解主要包括两条通路:泛素—蛋白酶体通路和自噬—溶酶体通路。一直以来都认为这两条通路是相互独立的,但近来发现内质网功能和自噬之间存在相互关联[6,7],并且内质网相关降解蛋白Derlin-1可能是两者间可能的对话分子。同时Derlin-1表达异常可导致肿瘤等多种疾病,并与肿瘤的发生、发展及预后等密切相关[8]。本课题组在前期研究中发现HPV16 E6过表达可以使内质网应激标志物GRP78和自噬蛋白Beclin 1表达增加[9],本研究拟在此基础上探讨HPV16 E6过表达后Derlin-1表达的变化,以及Derlin-1表达变化对自噬蛋白的影响,旨在发现两条蛋白通路间的对话分子。

1 材料和方法

1.1 实验材料

Derlin 1(N-20,sc-46913)多克隆抗体、Beclin1(H-300,sc-11427)多克隆抗体,GRP78(H-129,sc-13968)多克隆抗体和β-actin(C4,sc-47778)单克隆抗体购买自Santa Cruz公司,P62(D5E2,8025S)多克隆抗体购买自Cell Signaling公司。lipofectamine2000、G418购自美国Invivogen公司。Tunicamycin(TM)购自美国Sigma Aldrich公司。细胞组织裂解液RIPA及蛋白酶抑制剂PMSF购自上海申能博彩公司,BCA蛋白定量试剂盒为美国PIERCE公司产品,DMEM培养基、胎牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司产品,宫颈癌细胞株C33A购自美国典型物种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),由本实验室保种。

1.2 实验方法

1.2.1 载体构建 HPV16 E6真核表达质粒pcDNA3.1(-)-HPV16 E6[9]、Derlin-1的干扰质粒PSUPER-siDerlin-1[10]由本实验室自行构建并保存。

1.2.2 C33A细胞培养 将人宫颈癌细胞C33A置于加入含有100 μg/ml链霉素、100 μg/ml青霉素和10%胎牛血清的DMEM(Gibco Invitrogen美国)培养基中,在5% CO2,37 ℃湿度饱和的培养箱中培养,取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3 HPV16 E6真核表达质粒转染C33A细胞 将宫颈癌C33A细胞以每孔5×105个细胞浓度于6孔板中接种,参照lipofectamine 2000的操作说明书进行转染,分别取pcDNA3.1(-)-HPV16 E6、pcDNA3.1(-)空质粒转染C33A细胞,转染24 h后用G418筛选(浓度为500 μg/ml),筛选3周后,选取阳性克隆细胞株进行扩大培养。并将两组细胞分别命名为:pcDNA3.1(-)-HPV16 E6组和pcDNA3.1(-)组,未做处理的C33A细胞设为空白对照组。

1.2.4 Derlin-1的干扰质粒转染经筛选的C33A细胞 选择稳定表达HPV16 E6的人宫颈癌细胞C33A细胞,培养至对数生长期,分别取PSUPER-siDerlin-1和PSUPER质粒转染上述细胞,具体方法同1.2.3,分别计算数10个200倍视野中荧光的细胞占全部细胞的百分比。并将两组细胞分别命名为:PSUPER-siDerlin-1组和PSUPER组,未再做处理的稳定表达HPV16 E6的人宫颈癌细胞C33A设为空白对照组。

1.2.5 Western blot检测HPV16 E6、Beclin1、P62和GRP78、Derlin 1蛋白的表达水平 预冷的PBS洗涤细胞两次,6孔板每孔细胞加入100 μl RIPA和1 μl PMSF,收集细胞放置于冰上30 min,离心,上清液即为总蛋白粗提液。BCA法测定蛋白含量,取50 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳,通过半干电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h,加入HPV16 E6多克隆抗体(工作浓度1 ∶300),Beclin1多克隆抗体(工作浓度1 ∶750),P62多克隆抗体(工作浓度1 ∶500),GRP78多克隆抗体(工作浓度1 ∶100),Derlin 1多克隆抗体(工作浓度1 ∶400);4 ℃冰箱振荡过夜,次晨用含0.1% Tween20的TBST洗涤,加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(工作浓度1 ∶10 000),室温孵育1 h,TBST洗3遍,TBS洗膜,在PVDF膜上均匀地涂抹化学发光底物,暗室内X线片曝光显影,在凝胶成像分析系统中成像并测量特异性条带的表达强度。

1.2.6 Tunicamycin(TM)诱导细胞内质网应激 将TM以2 mg/ml的浓度溶解于二甲基亚砜中,-20 ℃保存。C33A细胞以每孔5×105个细胞浓度接种于6孔板中,24 h后以2 μg/ml TM处理24 h,终止反应,PBS洗2次,收集细胞备用。

1.2.7 统计学方法 实验所得数据录入SPSS 20.0统计软件进行分析,计数资料采用χ2检验或Fishier确切概率,计量数据组间比较采用单因素方差分析,多组间两两比较用SNK法,检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TM对内质网应激蛋白GRP78和Derlin-1表达的影响

以内质网应激诱导剂TM处理C33A细胞24 h,Western blot检测内质网应激标志物GRP78和Derlin-1的表达,结果显示,TM处理前后GRP78/β-actin的灰度比值分别是0.37±0.21和0.62±0.17,Derlin-1/β-actin的灰度比值分别是0.13±0.05和0.32±0.11,表明TM处理C33A细胞24 h后,GRP78和Derlin-1表达明显增加(P<0.05,见图1)。提示TM成功诱导内质网应激,并激活泛素—蛋白酶体通路。

与TM处理前相比,*P<0.05图1 TM对内质网应激蛋白GRP78和Derlin-1表达的影响Figure 1 Effect of TM on the expression of endoplasmic reticulum stress proteins GRP78 and Derlin-1 by Western blot

2.2 TM对自噬蛋白Beclin 1和P62表达的影响

以内质网应激诱导剂TM处理C33A细胞,Western blot检测自噬蛋白Beclin 1、P62的表达,结果显示,TM处理前后Beclin 1/β-actin的灰度比值分别是0.24±0.13和0.59±0.14,P62/β-actin的灰度比值分别是0.71±0.25和0.13±0.05,表明TM处理C33A细胞24 h后,Beclin 1表达增加,而P62表达降低(P<0.05,见图2),提示内质网应激时自噬—溶酶体通路被激活。

与TM处理前相比,*P<0.05图2 TM对自噬蛋白Beclin 1和P62表达的影响Figure 2 Effect of TM on the expression of Beclin 1 and P62 proteins by Western blot

2.3 HPV16 E6过表达对GRP78、Derlin-1、Beclin 1、P62表达的影响

用不同质粒转染C33A细胞,pcDNA3.1(-)-HPV16 E6组、pcDNA3.1(-)组和空白对照组HPV16 E6/β-actin的Western blot灰度比值分别是0.74±0.19,0.45±0.21和0.38±0.22;pcDNA3.1(-)-HPV16 E6组HPV16 E6表达增加,明显高于pcDNA3.1(-)组和空白对照组(P<0.05),证明转染成功。Western blot检测各组细胞中内质网应激蛋白GRP78、Derlin-1和自噬蛋白Beclin 1、P62的表达变化,可以看出当HPV16 E6过表达后GRP78、Derlin-1表达增加(P<0.05),自噬蛋白Beclin 1表达增加(P<0.05),P62的表达降低(P<0.05,见图3),这与TM干预C33A后结果相同。

与pcDNA3.1(-)组和空白对照组相比,*P<0.05图3 HPV16 E6过表达对GRP78、Derlin-1、Beclin 1、P62表达的影响Figure 3 Effect of overexpression of HPV16 E6 on the expression of GRP78, Derlin-1, Beclin 1, P62 by Western blot

2.4 抑制Derlin-1蛋白表达对自噬通路的影响

选择稳定表达HPV16 E6的人宫颈癌细胞C33A细胞,分别取PSUPER-siDerlin-1和PSUPER质粒转染上述细胞,Western blot检测各组细胞中Derlin-1和自噬蛋白Beclin 1、P62的表达变化,结果显示,与PSUPER组和空白对照组比较,PSUPER-siDerlin-1组Derlin-1表达降低,自噬蛋白Beclin 1表达增加,同时P62表达也增加(P<0.05,见图4),提示自噬流被阻断,Derlin-1同时参与自噬—溶酶体通路。

与PSUPER组和空白对照组相比,*P<0.05图4 抑制Derlin-1对Derlin-1、Beclin 1、P62表达的影响Figure 4 The effect of inhibition of Derlin-1 on the expression of Derlin-1, Beclin-1 and P62 proteins by Western blot

3 讨论

Derlin-1是一个多功能蛋白,最初发现在内质网应激中表达增加,参与错误折叠和未折叠蛋白的逆向转运,从而使其降解,使细胞免于凋亡,以帮助内质网恢复稳态。近来研究发现Derlin-1表达异常与肿瘤等多种疾病有关:Wang等[11]研究发现Derlin-1在正常乳腺中几乎不表达,而在乳腺癌组织中过度表达,并且与肿瘤的分级及淋巴结的转移有关,其机制为内质网应激引起Derlin-1在乳腺癌组织中过度表达,保护乳腺癌细胞免受内质网应激引起的凋亡。肺癌中的研究也提示Derlin-1可在61.86%非小细胞肺癌中表达,并与肿瘤的淋巴转移及肿瘤的TNM分期有关,Derlin-1的高度表达与肺癌病人的预后呈负相关[12]。本课题组在既往的研究中发现抑制自噬可以加重内质网应激,进而导致宫颈癌细胞凋亡[13]。本研究拟了解内质网相关降解蛋白Derlin-1是否通过参与自噬过程执行其癌基因的功能。

病毒感染会产生大量的癌蛋白,这些蛋白在内质网的聚集会导致内质网应激,HPV也是这样,HPVE6、E7等癌蛋白的堆积会引发内质网应激的发生,此时内质网应激的标志物GRP78表达增加,自噬被激活,通过自噬—溶酶体通路使内质网功能修复避免死亡[14]。近来发现泛素—蛋白酶体通路和自噬—溶酶体通路之间存在关联,Derlin-1可能是两者间的对话分子[5,6]。本研究先采用内质网应激激动剂TM处理宫颈癌C33A细胞,发现GRP78表达增加,表明TM成功诱导内质网应激。同时Derlin-1的表达也明显增加,表明在此情况下泛素—蛋白酶体通路被激活。随后检测自噬蛋白Beclin 1、P62的表达,发现Beclin 1表达增加,表明自噬启动,P62表达降低表明自噬溶酶体降解,自噬流畅通,提示内质网应激时自噬—溶酶体通路激活。之后采用HPV16 E6过表达载体转染宫颈癌C33A细胞,使HPV16 E6癌蛋白过度表达,发现在此种情况下,发生了TM出来C33A细胞后相同的效应,即诱发了内质网应激(GRP78表达增加),同时Derlin-1、Beclin 1的表达增加,P62表达减少,提示当病毒蛋白作用于C33A细胞后,诱发了内质网应激,此时泛素—蛋白酶体通路和自噬—溶酶体通路均被激活,以缓解细胞的压力,避免凋亡。

为了解Derlin-1是否通过参与自噬过程,本研究采用RNA干扰技术沉默了过表达HPV16 E6细胞中Derlin-1的表达,发现伴随Derlin-1表达的降低,Beclin 1的表达并未出现明显的变化,而p62的表达却出现增加,提示当Derlin-1的表达降低后,自噬的启动过程并没有受到影响,但是自噬溶酶体的降解被阻断,自噬流受阻。提示在HPV16感染的内质网应激环境下,敲除Derlin-1可以影响P62蛋白的降解,导致自噬通路的受阻,Derlin-1在自噬溶酶体降解阶段参与了自噬过程,Derlin-1可能是泛素—蛋白酶体通路和自噬—溶酶体通路之间的对话分子,两条蛋白质的降解通路可能在内质网应激过程中发挥协同作用,维持细胞的稳态,这一机制可能参与了HPV16的致宫颈癌过程。