王旭堂 刁志祥 张培杨 谢恺舟 王波 刘楚君 张跟喜 张涛 刘学忠 戴国俊

摘要：本研究旨在建立鹌鹑蛋和鸽蛋中甲砜霉素（TAP）残留的超高效液相色谱-荧光检测（UPLC-FLD）方法。以鹌鹑蛋和鸽蛋为试验材料，采用加速溶剂萃取（ASE）技术提取目标物，以乙腈饱和的正己烷去脂，净化后用UPLC-FLD法进行检测分析。结果表明，在鹌鹑蛋和鸽蛋中TAP的添加质量比在定量限（LOQ）至250.0 μg/kg内，线性关系良好，决定系数均大于0.999 2。TAP添加质量比为LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL时，在鹌鹑蛋和鸽蛋中的回收率分别为83.23%～95.72%、84.37%～97.12%，检测限（LOD）分别为3.4 μg/kg、3.3 μg/kg，LOQ分别为9.9 μg/kg、9.7 μg/kg。检测方法快速、高效、灵敏度高，为鹌鹑蛋和鸽蛋中TAP残留检测提供了新方法。

关键词：鹌鹑蛋;鸽蛋;甲砜霉素;加速溶剂萃取;超高效液相色谱-荧光检测法

中图分类号：S859.84文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）01-0206-06

Abstract： This study aimed to establish an ultra-high performance liquid chromatography-fluorescence detection （UPLC-FLD） method for the determination of thiamphenicol （TAP） residues in quail eggs and pigeon eggs. Using quail eggs and pigeon eggs as test materials， the target compound was extracted by accelerated solvent extraction （ASE） technique， and degreased by n-hexane saturated with acetonitrile. After purification， it was detected and analyzed by UPLC-FLD method. The results showed that the mass ratio of TAP in quail eggs and pigeon eggs was in the range of the limit of quantification （LOQ） to 250.0 μg/kg， and the linear relationship was good. The coefficients of determination were greater than 0.999 2. When TAP was added at mass ratios of LOQ， 0.5 maximum residue limit （MRL）， 1.0 MRL and 2.0 MRL， the recoveries in quail eggs and pigeon eggs were 83.23%-95.72%， 84.37%-97.12%， the detection limits were 3.4 μg/kg and 3.3 μg/kg， and the quantitative limits were 9.9 μg/kgand 9.7 μg/kg， respectively. The detection method used in this study is rapid， efficient and sensitive， which provides a new method for the detection of TAP residues in quail eggs and pigeon eggs.

Key words：quail eggs;pigeon eggs;thiamphenicol;accelerated solvent extraction;ultra-high performance liquid chromatography with fluorescence detection

甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP），別名硫霉素，甲砜氯霉素，是人工合成的氯霉素的同类物，属于广谱抗菌药物。主要用于防治需氧革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌、厌氧菌、立克次体属病菌、螺旋体病菌和衣原体属病菌等引起的疾病。通过抑制细菌蛋白质的形成，起到抑菌效果。由于其对畜禽的多种细菌性疾病有良好的治疗效果，在畜禽生产中已被广泛使用。

禽蛋作为来源最广，蛋白质含量较高的动物性食品，近年来其需求量日益增大。而养殖者为了提高经济效益，常将TAP等抗生素药物不合理地用于禽类，导致药物残留于禽蛋中。因为TAP具有较强的抑制红细胞、白细胞和血小板生成的作用，影响人类健康，所以许多国家都对这种药物的最高残留限量做出了规定[1-3]。为了保证禽蛋的质量安全，TAP的残留检测也日益重要。目前常用的检测方法主要包括气相色谱法（Gas chromatography，GC）[4-6]、气质联用法（Gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[7-9]，液相色谱法（Liquid chromatography，LC）[10-12]和液质联用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[13-14]。国内外利用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）检测动物性食品中TAP的研究多有报道，而利用超高效液相色谱法（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）的报道较少。本研究采用了加速溶剂萃取（ASE）的方法，实现了提取剂与目标物更好的接触，提高萃取效率[15]，并利用UPLC分离，荧光检测器（Fluorescence detector，FLD）检测，建立了超高效液相色谱-荧光检测法检测鹌鹑蛋和鸽蛋中TAP残留的方法，为鹌鹑蛋和鸽蛋中TAP残留标准的制定提供了依据。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

超高效液相色谱仪（Acquity UPLC型），由美国Waters公司生产;荧光检测器（Acquity FLD型），由美国Waters公司生产;加速溶剂萃取仪（ASE350型），由美国Thermo Fisher公司生产;离心浓缩仪（ScanSpeedVac40型），由丹麦LaboGene公司生产;超纯水制备仪（Smart2-Pure），由美国Thermo Scientific公司生产;甲砜霉素标准品（纯度≥99.0%）（CAS号：15318-45-3），由德国Dr. Ehrenstorfer GmbH有限公司生产;乙腈、甲醇（色谱纯），由美国Tedia 有限公司生产;十二烷基硫酸钠（分析纯，纯度≥95.0%），由北京索莱宝科技有限公司生产;其他试剂均购买于国药集团化学试剂有限公司，试验用水为超纯水。

1.2标准溶液的制备

准确称取甲砜霉素4.0 mg，用乙腈溶解、定容至10 ml，充分摇匀，配制成400.0 mg/L的标准贮备液，分装，密封，置-70 ℃超低温冰箱中保存。将标准贮备液用36%（体积比）的乙腈水溶液逐级稀释成不同质量浓度的甲砜霉素标准工作液，分装，密封，置-34 ℃冰箱中保存备用，可稳定保存30 d。

1.3样品的提取与净化

ASE提取：分别准确称取（2.00±0.02） g均质好的鸽蛋和鹌鹑蛋样品置于研钵中，与适量硅藻土研磨至粉末状，以达到最佳的萃取效果。之后装入22 ml萃取池（若池子留有空隙则用硅藻土填满）中，放在加速溶剂萃取仪的机械臂上进行萃取，萃取剂为2%的氨水乙腈，其萃取方法及参数如下：萃取压力为1 500 psi，萃取温度为80 ℃，萃取時间为5 min，萃取剂用量约为池体积的40%，每个样品之间自动冲洗1次，氮气吹扫时间60 s，静态循环萃取2次，最后收集萃取液，待用。

样品的净化：将萃取液转移至50 ml离心管，置于离心浓缩仪（转速为2 000  g）上浓缩接近干燥，加入1 ml纯乙腈涡旋震荡溶解残渣，加入8 ml乙腈饱和的正己烷去脂，涡旋震荡后静置5 min，弃去上层正己烷，重复去脂1次，然后将萃取液置于离心浓缩仪上浓缩至干。将浓缩干燥后的样品用2.0 ml流动相复溶，涡旋1 min，以12 100  g离心15 min，过0.22 μm聚偏氟乙烯（PVDF）针式滤器，滤液供UPLC-FLD检测。

1.4方法的建立

1.4.1色谱质谱条件色谱柱（Acquity UPLC BEH C18，2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm），流动相A：超纯水（含0.005 mol/L的NaH2PO4溶液，0.003 mol/L十二烷基硫酸钠和0.05%的三乙胺，pH 5.3±0.1），流动相B：乙腈，等度洗脱A∶B=64∶36（体积比），检测器：荧光检测器（激发波长233 nm，发射波长284 nm），流速：0.2 ml/min，进样体积：10 μl，柱温：30 ℃。

1.4.2标准曲线分别准确称取10份（2.00±0.02） g匀浆好的鸽蛋和鹌鹑蛋的全蛋空白样品，进行提取和净化后得到空白样品基质提取液。然后分别移取适量的基质提取液将标准工作液稀释成定量限（LOQ）、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg、100.0 μg/kg、150.0 μg/kg、200.0 μg/kg、250.0 μg/kg等系列质量比，在UPLC-FLD条件下进行分析。分别以甲砜霉素标准工作液在不同空白基质中的添加质量比为自变量（x），峰面积为因变量（Y），绘制甲砜霉素在鸽蛋和鹌鹑蛋中残留量测定的标准曲线。

1.4.3样品回收率的测定分别准确称取（2.00±0.02） g匀浆好的空白鸽蛋和鹌鹑蛋样品，将样品与硅藻土研磨均匀后，分别加入甲砜霉素标准工作液适量，使其对应在各空白样品中的添加质量比为LOQ、0.5 MRL（最高残留限量）、1.0 MRL和2.0 MRL，搅拌混匀萃取，每个添加水平设置6个平行，经提取净化后，UPLC-FLD检测，最后将检测结果对照标准曲线求得质量比，计算样品回收率。

1.4.4精密度的测定精密度分为日内（批内）精密度和日间（批间）精密度，常用相对标准偏差（RSD）来评估。日内（批内）精密度：同一天不同时间点用同一台仪器和同一条标准曲线测定，每个添加浓度设6个平行，求出日内RSD。日间（批间）精密度：一周内的不同天用不同的标准曲线（每天都绘制标准曲线）同一台仪器测定，每个添加质量比设6个平行，求出日间RSD。

1.4.5检测限与定量限测定取空白样品进行添加回收试验，并用已建立的UPLC-FLD方法进行分析。每个质量比分析3次，得出信噪比（S/N）平均值。当信噪比大于等于3（S/N≥3）时所对应的添加质量比即为分析方法的检测限（LOD）;当信噪比大于等于10（S/N≥10）时所对应的添加质量比即为分析方法的定量限（LOQ）。此外，LOQ质量比点还应满足准确度和精密度的要求（一般要求回收率>70%，相对标准偏差RSD≤20%），才能证明此分析方法可靠。

2结果与分析

2.1标准曲线、线性范围与决定系数

由图1和图2可以看出，甲砜霉素在鸽蛋和鹌鹑蛋中添加质量比为LOQ至250 μg/kg，其峰面积与质量比均呈良好的线性关系。线性范围、线性回归方程及决定系数（R2）见表1。

2.2色谱图

色谱图见图3、图4，在UPLC-FLD检测条件下，甲砜霉素在鸽蛋和鹌鹑蛋中与杂质实现了较好的分离，峰形对称且保留时间在1.50 min左右，与标准品色谱图目标化合物的保留时间接近。

2.3添加回收率、精密度、检测限与定量限

空白鸽蛋和鹌鹑蛋中添加甲砜霉素质量比在LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL水平时，甲砜霉素添加回收率及精密度见表2。由表2可知，甲砜霉素在鸽蛋和鹌鹑蛋中添加质量比为LOQ至2.0 MRL时，甲砜霉素在鸽蛋和鹌鹑蛋中的添加回收率分别为83.23%～95.72%和84.37%～97.12%，相对标准偏差（RSD）分别为2.75%～3.87%和1.99%～3.70%，日内RSD分别为2.78%～4.32%和2.74%～3.91%，日间RSD分别为3.36%～5.22%和3.44%～4.98%。经过添加回收试验可得，鸽蛋和鹌鹑蛋中甲砜霉素的LOD分别为3.4 μg/kg、3.3 μg/kg，LOQ分别为9.9 μg/kg、9.7 μg/kg。结果表明，此方法灵敏度高，完全满足鹌鹑蛋和鸽蛋中甲砜霉素残留检测的要求，符合中国农业农村部、欧盟、美国甲砜霉素残留检测的规定[1-3]。

2.4最佳提取方法

本研究比较了超声提取、涡旋震荡提取、涡旋震荡+超声提取和ASE提取对鸽蛋和鹌鹑蛋中甲砜霉素提取效果的影响，结果见表3。在超声和涡旋震荡条件下，TAP的回收率较低，虽然利用超声结合涡旋震荡的方法提取的回收率与ASE法提取的回收率接近，但ASE法提取后不需要再结合SPE柱进行净化，减少了操作带来的误差的同时，也缩短了前处理所用的时间。此外，本研究中还对不同比例提取剂进行了效果对比，结果见表4，由表4可发现，提取剂选择乙腈∶氨水（98∶2，体积比）时效果最佳，目标物的回收率均在92.0%以上。最后試验对ASE提取方法的温度和提取时间进行了优化，分别比较了40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃温度下，2 min、3 min、5 min、8 min时TAP的回收率，最终发现在80 ℃，5 min时为最佳的萃取条件，可获得最佳的效果。

3讨论

3.1样品前处理方法的优化

在研究过程中，样品的前处理对试验结果的准确性有着很大的影响。Xie等[16]以乙酸乙酯∶乙腈∶氢氧化铵（49∶49∶2，体积比）作为提取剂，利用液液萃取的方法提取鸡蛋中的TAP、氟苯尼考（FF）和氟苯尼考胺（FFA），经己烷脱脂后，用反相高效液相色谱-荧光检测法检测，TAP回收率在86.4%以上;Alechagaee等[17]采用固相萃取的方法，在甲醇与乙酸-乙酸铵缓冲液（5 mmol/mol，pH 5）色谱柱条件下提取动物源食品中的TAP、氟苯尼考（FF）和氟苯尼考胺（FFA），再通过UPLC-MS/MS检测法检测分析，也获得了较好的检测效果。

3.2UPLC-FLD检测条件的优化

在色谱法检测中，色谱柱与流动相的选择是影响检测结果的重要因素。Evaggelopoulou等[18]、Zhang等[19]以及Sichilongo等[20]检测动物源食品中氯霉素类药物残留时都利用了C18色谱柱，均获得了较好的检测效果。因此本试验中也采用了ACQUITY UPLCR BEH C18 （2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）柱。本研究在谢恺舟等[21]利用高效液相色谱荧光检测法检测鸡蛋中甲砜霉素残留量的基础上，比较了1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L十二烷基硫酸钠，0 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L NaH2PO4，0.01%、0.03%、0.05%和0.10%三乙胺用量和不同pH值对目标化合物所产生的影响，并对流动相进行优化。通过对比得出，以乙腈为流动相A，以内含5 mmol/L磷酸二氢钠、3 mmol/L十二烷基硫酸钠和0.05%的三乙胺水溶液（调pH为5.3±0.1）作为流动相B（A∶B=36∶64，体积比），TAP的色谱峰与杂质峰达到很好的分离。同时进一步优化目标物质的检测波长，最终选择了激发波长233 nm，发射波长284 nm，在此条件下既达到了目标物的高响应值，又无杂质的干扰。

3.3UPLC-FLD法的突出优势

UPLC是在HPLC的理论及原理基础上发展起来的一个新兴的领域，与传统的HPLC相比，UPLC采用了更短的色谱柱和更高的流速，使得分离效果更突出。在同样条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍以上，得出的图谱也更精确。同时，UPLC能以较快的速度或较好的分辨率完成对特征分析的高通量库筛选，而这两点都能使分离效率得到提高，效率的提高进一步提高了灵敏度。总体而言，UPLC突破了普通HPLC的极限，在相同条件下，UPLC的速度、灵敏度及分离度更高，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量，降低了分析成本，结合检测精度更高的FLD检测器，使得研究结果更加精确。为这种分离技术的广泛应用提供了可能。

本试验首次建立了ASE-UPLC-FLD方法，检测鹌鹑蛋和鸽蛋中TAP的残留量，为动物源食品中TAP的残留检测提供了新的技术方法。该检测方法简便、快速、高效，检测结果满足美国、欧盟和中国对动物性食品中甲砜霉素残留检测的要求。

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（责任编辑：陈海霞）