张娟琴 李双喜 郑宪清 张翰林 白娜玲 张海韵 吕卫光

摘要：為了探明蚯蚓对西瓜枯萎病的影响机制，开拓西瓜枯萎病防控的新思路，本试验以西瓜连作土壤为基质，采用盆栽试验，研究不同密度的威廉环毛蚓（Pheretima guillelmi）和赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）对西瓜长势、枯萎病发病率的影响，结合西瓜专化型尖孢镰刀菌数量、土壤微生物总量（土壤微生物量碳含量）、土壤微生物活性（土壤脱氢酶活性）以及土壤总酚酸的动态变化，探索蚯蚓对西瓜植株枯萎病的防控机理。结果表明，西瓜定植后45 d，试验组的西瓜蔓长、鲜质量较不投放蚯蚓对照分别增长了18.57%～67.27%、39.29%～87.24%。西瓜定植后30 d、45 d，对照的西瓜植株枯萎病发病率分别为62.15%、85.32%，显著高于蚯蚓试验组（P<0.05）。在一定范围内增加蚯蚓密度能有效促进西瓜生长，减缓枯萎病发生。在蚯蚓质量相同的情况下，威廉环毛蚓的促生防病效果优于赤子爱胜蚓。0～45 d的试验过程中，试验组土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）数量、总酚酸含量较对照分别下降了36.63%～69.39%、31.0%～77.4%，45 d时试验组的土壤微生物量碳含量、土壤脱氢酶活性较对照分别提高了115.10～175.71 mg/kg、1.41～2.40 μg/（g·h）。蚯蚓能有效降低西瓜植株枯萎病的发病率，促进植株生长，其防控机理可能为：蚯蚓的穴居、取食等活动直接抑制土壤中尖孢镰刀菌的快速繁殖，同时蚯蚓通过降解土壤化感物质（总酚酸），提升微生物总量和活性等方式调控土壤微生物群落结构，改善土壤微生态环境，从而有效防控西瓜枯萎病的发生。

关键词：西瓜枯萎病;蚯蚓;西瓜专化型尖孢镰刀菌;总酚酸;土壤微生物量碳;脱氢酶

中图分类号：S651;S436.5文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）01-0070-07

Abstract：In order to explore the influence mechanism of Pheretima guillelmi and Eisenia foetida on watermelon Fusarium wilt and develop new ideas for the controlling， pot experiments were conducted to study the effects of different densities of Pheretima guillelmi and Eisenia foetida on watermelon vine length， fresh weight and incidence of Fusarium wilt. In addition， the control mechanism was explored by combining with the dynamic changes of Fusarium oxysporum f.sp. niveum， total phenolic acid， microbial biomass carbon and dehydrogenase activity in soil. The results showed that the vine length and fresh weight of watermelon in the experimental groups increased by 18.57%-67.27% and 39.29%-87.24% compared with those in control group at the 45th day after planting. At the 30th and 45th days， the wilt incidence of watermelon in the control group was 62.15% and 85.32%， respectively， which was significantly higher than that in the earthworm experimental groups（P<0.05）. Increasing the earthworm density in a certain range could effectively promote the growth of watermelon and inhibit Fusarium wilt. Under the same weight， the growth and disease prevention effect of Pheretima guillelmi was better than that of Eisenia foetida. During the 0-45 days， the number of Fusarium oxysporum f.sp. niveum and total phenolic acid content in the soil of the earthworm experimental group decreased by 36.63%-69.39% and 31.0%-77.4%， respectively. At the 45th day， soil microbial biomass carbon and dehydrogenase activity in the earthworm experimental groups increased by 115.10-175.71 mg/kg and 1.41-2.40 μg/（g·h） compared with those in control group. Pheretima guillelmi and Eisenia foetida could effectively reduce the incidence of watermelon Fusarium wilt and promote plant growth. The mechanism may be that activities（ burrowing and feeding） of earthworms directly inhibited the rapid propagation of Fusarium oxysporum in soil， and earthworms controlled soil microbial community structure by degrading soil allelochemicals （total phenols）， increasing total microbial biomass and microbial activity. In conclusion， the soil micro-ecological environment was improved， and the occurrence of watermelon Fusarium wilt was effectively controlled.

Key words：watermelon Fusarium wilt;earthworm;Fusarium oxysporum f.sp. niveum;total phenolic acid;soil microbial biomass carbon;dehydrogenase

随着耕地面积的减少，连作现象普遍增加，而连作模式破坏了土壤微生态环境，引起微生物群落结构的改变，导致严重的连作障碍[1-2]。西瓜连作障碍的主要病害为枯萎病，严重制约西瓜种植业的发展。目前，西瓜枯萎病的防治措施主要包括嫁接换根、化学防治、生物防治以及培育抗病品种等[3-5]，虽然有一定效果，但均存在一定的局限性，如西瓜品质差，易造成二次污染等。

作为土壤生态系统工程师，蚯蚓在改善土壤理化性质，推动养分循环，调控土壤微生物活性、群落结构和功能等方面均具有重要作用[6]。蚯蚓可以促进植物生长，其数量也是表征土壤健康的重要指标[7-8]。关于蚯蚓对土壤微生态调控的研究很多，但是关于蚯蚓防控连作障碍的研究相对较少，并且主要集中在蚯蚓粪的功效研究[9]。Szczech[10]报道，生长介质中蚯蚓粪的加入量与其对病原真菌的抑制效果正相关，但经高温灭菌后，蚯蚓粪的抑病性丧失，表明是生物因素在发挥作用。蚯蚓堆肥能明显降低西瓜和番茄的枯萎病发病率，提高壮苗指数，改善品质[11-12]。毕艳孟[13]通过研究蚯蚓对草莓枯萎病的防控效应，发现蚯蚓能有效降低草莓枯萎病的病情指数。西瓜连作后土壤微生态环境恶化，不利于西瓜生长。本试验拟选取正蚓科食碎屑类表栖型的赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）和巨蚓科食土类深栖型的威廉环毛蚓（Pheretima guillelmi）2种蚯蚓[6，14]，二者亲缘关系较远，同时前者为常见的养殖种，后者为自然环境中常见的野生种，具有一定的典型性和代表性。采用不同密度的赤子爱胜蚓和威廉环毛蚓，在连作5年的西瓜土壤中预培育90 d后移栽西瓜苗，調查西瓜长势和枯萎病的发病率，同时监测土壤微生物量碳含量、脱氢酶活性、总酚酸含量、西瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）数量等的动态变化，旨在探索蚯蚓对西瓜枯萎病的防控效果及其机理，以期为西瓜枯萎病的防控提供理论依据和新思路。

1材料与方法

1.1试验材料

供试土壤取自上海市农业科学院庄行试验站西瓜连作5年的大棚，西瓜连作障碍严重，其西瓜枯萎病的发病率在60%以上。在2018年3月取0～20 cm土壤，按照一定比例（土壤∶牛粪=9∶1，质量比）在连作土壤中添加牛粪，为蚯蚓和西瓜的生长提供饵料和养分。试验土壤基本性状：pH 7.72、电导率1.18 mS/cm、有机质含量18.1 g/kg、全氮含量1.46 g/kg、全磷含量2.04 g/kg、全钾含量15.83 g/kg 、速效氮含量80.39 mg/kg、速效磷含量85.93 mg/kg、速效钾含量640.03 mg/kg。牛粪基本性状：水分含量39.46%、有机质含量42.20 g/kg、全氮含量8.82 g/kg、全磷含量7.38 g/kg、全钾含量5.88 g/kg。

供试蚯蚓赤子爱胜蚓（太平2号）购自江苏无锡的养殖基地，威廉环毛蚓取自于上海市农业科学院崇明试验基地。试验前先将2种蚯蚓放入试验土壤中预培养7 d，以便蚯蚓适应试验土壤环境，同时用试验土壤替代蚯蚓体内原有的内容物，减少试验误差。挑选长势均匀，单体质量分别为3.0～3.5 g的威廉环毛蚓和0.3～0.4 g的赤子爱胜蚓为试验蚯蚓。

采用直径30 cm、高40 cm的圆柱形铁桶作为试验容器，底部打4个孔，四周打6个孔，底部和四周打孔处内附50目细纱网，铁桶上口同样采用50目细纱网覆盖，防止蚯蚓爬出。

供试西瓜品种为早春红玉，幼苗苗龄为30 d，具有3～4片真叶时选取叶片宽厚无损、色浓健壮的西瓜苗进行定植。温室温度20～30 ℃，西瓜苗大概每隔5 d浇一次水，保证土壤含水量在20%左右。

1.2试验设计

每个试验容器底部放入100 g水稻秸秆（长约5 cm）和1 kg新鲜菜叶后，加入5 kg试验土壤，加入1 000  ml水，平衡24 h后投放蚯蚓。试验中蚯蚓密度的设置，以15 d 1 kg土壤中蚯蚓存活率超过99%的密度为上限，结合田间蚯蚓密度调查结果，同时为减少蚯蚓单体质量差异和个体数量的影响，选用单体质量分别为3.0～3.5 g的威廉环毛蚓和0.3～0.4 g的赤子爱胜蚓为试验蚓种，并且以条数为蚯蚓密度的计量单位，具体试验设置如下：不投放蚯蚓（CK），1 kg土壤投放1条、3条、5条威廉环毛蚓的P1、P3、P5处理，1 kg土壤投放5条、10条、15条赤子爱胜蚓E5、E10、E15的处理。由于2种蚯蚓单体质量差异较大，设置了一组（P1和E10）2种蚯蚓质量相同的试验处理，以便进行对比，投放蚯蚓后在容器表面放置20 g水稻秸秆（长约5 cm），为蚯蚓提供遮光环境，温室温度为25～30 ℃，相对湿度为70%～80%。培育90 d后，选取长势相似的西瓜幼苗移栽至试验盆中，每盆5株，每个处理15盆。西瓜定植0 d起，间隔15 d采用5点法采集0～20 cm的试验土壤，测定相关指标，同时从西瓜定植15 d起，每15 d统计一次西瓜长势和枯萎病发病率，当对照的发病率达到80%以上时，结束试验。

1.3测定方法

1.3.1西瓜植株长势指标的测定随机取3盆西瓜，采用米尺测量主蔓长，同时将西瓜苗整体挖出后，洗净根部土壤，用滤纸吸干西瓜植株上的水分，然后称量鲜质量。

1.3.2西瓜枯萎病发病率的测定西瓜枯萎病参照文献[15]的方法进行鉴别，并记录西瓜枯萎病（枯萎叶片数≥50%）发病株数，以发病植株占总株数的百分比表示发病率。

1.3.3土壤测定项目与方法西瓜专化型尖孢镰刀菌采用荧光定量PCR法测定[16]，土壤微生物量碳采用熏蒸提取-重铬酸钾氧化法测定[17]，土壤脱氢酶活性采用2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）分光光度法测定[18]，土壤总酚酸含量采用福林酚比色法测定[13，19]。

1.4数据处理

试验数据采用Excel 2007和SPSS 16.0统计软件进行分析，均值比较采用最小显著性差异法（LSD）进行分析，显著水平为0.05。

2结果与分析

2.1蚯蚓对西瓜长势的影响

图1显示，2种蚯蚓对西瓜主蔓长和鲜质量均有显著的促进作用，45 d时试验组主蔓长、鲜质量较对照分别增加了18.57%～67.27%、39.29%～87.24%。西瓜的长势与蚯蚓的密度和种类相关，同种蚯蚓，高密度处理的西瓜长势优于低密度处理（P<0.05），但是P3与P5、E5与E10处理间的差异均不显著。蚯蚓质量相同情况下，威廉环毛蚓（P1）处理的西瓜长势优于赤子爱胜蚓（E10）处理。

2.2蚯蚓对西瓜植株枯萎病发病率的影响

图2显示，西瓜定植后15 d，植株枯萎病的发病率低于3.00%，定植后30 d的发病率高于34.93%，其中CK的发病率为62.15%，显著高于蚯蚓试验组（P<0.05）;定植后45 d，CK的西瓜植株枯萎病发病率增长至85.32%，而试验组的发病率较30 d时仅略有增长。枯萎病的发病率与蚯蚓的密度成反比，但是P3与P5、E5与E10处理间的差异均不显著。蚯蚓质量相同情况下，威廉环毛蚓处理（P1）的枯萎病发病率低于赤子爱胜蚓（E10）处理。

2.3蚯蚓对土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌数量的影响

图3显示，在0～45 d的试验过程中，蚯蚓试验组土壤中的西瓜专化型尖孢镰刀菌数量较对照下降了36.63%～69.39%。土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌的数量与蚯蚓的密度总体成反比，但是P3与P5、E5与E10处理间的差异均不显著。45 d时，蚯蚓质量相同情况下，P1处理的土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌数量较E10处理降低了19.76%。

2.4蚯蚓对土壤微生物总量和微生物活性的影响

分别以土壤微生物量碳含量、土壤脱氢酶活性表征土壤微生物总量、土壤微生物活性，结果（图4、图5）显示，CK的土壤微生物量碳含量、土壤脱氢酶活性与试验组差异显著（P<0.05）。45 d时，蚯蚓试验组土壤微生物量碳含量、土壤脱氢酶活性较CK提高了115.10～175.71 mg/kg、1.41～2.40 μg/（g·h）。在整个试验过程中，CK的土壤微生物量碳含量、土壤脱氢酶活性分别为273.49～287.31 mg/kg、2.76～2.97 μg/（g·h）。0～45 d的取样过程中，蚯蚓试验组土壤微生物量碳含量总体呈先上升后下降的趋势，而土壤脱氢酶活性呈上升趋势，但30 d后P3、P5处理的土壤脱氢酶活性呈平稳状态。土壤微生物量碳含量和脱氢酶活性与蚯蚓的种类和密度相关，同种蚯蚓土壤微生物量碳含量和脱氢酶活性总体随蚯蚓密度的增大而升高，但是P3与P5、E5与E10处理间的差异均不显著。蚯蚓质量相同情况下，P1处理的土壤微生物量碳含量和脱氢酶活性均高于E10处理。

2.5蚯蚓对土壤总酚酸含量的影响

图6显示，整个试验过程中，蚯蚓试验组土壤中总酚酸含量较CK下降了31.0%～77.4%，随时间增加，CK的土壤总酚酸含量呈上升趋势，尤其30 d土壤总酚酸含量上升明显，这可能与30 d时CK的西瓜植株枯萎病发病率大幅增加，西瓜植株腐解产生酚类物质有关。比较2种蚯蚓处理组之间的土壤总酚酸含量，发现蚯蚓质量相同情况下，威廉环毛蚓处理P1的土壤总酚酸含量低于赤子爱胜蚓处理E10。同种蚯蚓处理之间土壤总酚酸含量与蚯蚓密度呈负相关，但是P3与P5、E5与E10处理间差异均不显著。

3讨论

3.1蚯蚓选取及生存状况

试验结束后，土壤表面有大量蚓粪，统计土壤中蚯蚓的数量发现投放赤子爱胜蚓的土壤中存在大量幼蚓，而投放威廉环毛蚓的土壤中蚯蚓数量基本没有变化，间接说明各个密度的蚯蚓均能很好地适应试验土壤。

3.2蚯蚓对西瓜长势和枯萎病发病率的影响

蚯蚓对植物生长有促进作用[20-22]。目前的报道主要集中在蚯蚓糞功效的研究，将蚯蚓直接应用于植物连作障碍防治的研究相对较少。有研究结果[11-12，23]表明，蚯蚓堆肥能促进植物生长，降低发病率。本试验发现，在西瓜连作土壤系统中，蚯蚓不仅促进了西瓜的生长，还降低了枯萎病的发病率，这与毕艳孟[13]的结论一致。蚯蚓促进植物生长主要通过增加养分的可利用性[22]，以及提高植物光合速率[13]等途径来实现。蚯蚓密度与西瓜长势正相关，与枯萎病的发病率负相关，但P3与P5处理间差异不显著，说明环境的容纳能力有限，威廉环毛蚓防控效果不会随密度的增大无限放大。赤子爱胜蚓E15处理的防控效果明显优于E5处理和E10处理，而E5处理与E10处理间差异不显著，说明枯萎病防控的最佳密度与蚯蚓的品种相关，这可能与蚯蚓的生活型有关。蚯蚓质量相同情况下，威廉环毛蚓P1处理的西瓜长势及枯萎病防控效果均优于赤子爱胜蚓E10处理，这也间接验证了枯萎病防控的最佳密度与蚯蚓种类相关的这一结论。

3.3蚯蚓防控西瓜连作障碍的机理初探

在连作环境中，连作障碍的发生与化感物质的积累以及土壤微生物群落失衡有关[24-25]。西瓜连作障碍的主要病害为西瓜专化型尖孢镰刀菌引起的枯萎病，在0～45 d的试验过程中，西瓜专化型尖孢镰刀菌的数量呈上升趋势，但是蚯蚓试验组西瓜专化型尖孢镰刀菌的数量显著低于CK，这可能与蚯蚓活动以及取食偏好有关。Shan等[26]通过同位素标记法证实，相对于细菌，威廉环毛蚓偏好取食真菌，除了取食外，蚯蚓的穴居同样扰动了真菌菌丝体的生长[27]。西瓜定植后15 d，同一处理在不同取样时间下的西瓜专化型尖孢镰刀菌数量差异不显著，而西瓜枯萎病在西瓜定植后30 d左右暴发，之后蚯蚓试验组的发病率较平稳，这可能与蚯蚓影响土壤微生物群落结构有关。枯萎病的发病率与尖孢镰刀菌数量直接相关，但是发病相对滞后，这可能与病原菌侵染过程中土壤微生态环境的影响及西瓜植株防御反应有关。

蚯蚓对土壤微生物总量和活性有重要的调控作用[12]。大量研究结果表明，蚯蚓的活动能增加土壤微生物总量并增强其活性[1，13，20，23，28-29]，本试验也得出了相似的结果。但是，微生物总量和活性与蚯蚓的密度和品种相关，一定范围内提高蚯蚓密度能增加土壤微生物总量和活性，这可能与相同生态环境对不同生活型蚯蚓的容纳能力不同有关。蚯蚓质量相同时，威廉环毛蚓P1试验组土壤微生物总量和活性均显著高于赤子爱胜蚓E10试验组，这与前人的研究结果[13]相似。但也有研究结果表明，蚯蚓活动会降低土壤微生物总量，如Zhang等[30]指出，在土壤中接种威廉环毛蚓和赤子爱胜蚓24 h后，土壤中微生物量均显著下降;Gomez-Brandon等[31]研究安德爱胜蚓肠道时，发现粪便中微生物量低于食物中的量，这可能与研究时长及研究环境不同有关。

植物根系分泌及其残体腐解产生的化感物质会影响土壤微生物群落结构[32-33]，而酚酸类物质作为土壤中重要的化感物质对土壤病原菌的生长有促进作用[9]。Bi等[34]报道，蚯蚓能显著降低连作草莓土壤中酚酸含量，这与本试验的结果一致。本试验中，随着时间的延长，对照的土壤总酚酸含量呈上升趋势，西瓜定植后45 d时总酚酸含量高于西瓜定植后30 d时总酚酸含量，这可能与西瓜定植后30 d左右暴发式发病后，残体增多有关。试验组土壤总酚酸含量呈下降趋势，这可能与蚯蚓培育土壤过程中持续降解酚酸，使土壤总酚酸含量维持在较低水平有关，蚯蚓是通过调控土壤微生物来降解酚酸类物质的[34]，因此土壤总酚酸含量在一定水平内维持相对稳定，可以减弱其对病原菌的促生诱导。

综上所述，西瓜连作土壤系统中西瓜、土壤微生物、蚯蚓相互影响，蚯蚓防控西瓜的连作障碍，可能主要是通过降解化感物质，减缓西瓜分泌物或残体降解物（酚酸类）对病原微生物的定向促进，同时通过穴居、取食等活动抑制病原菌的快速繁殖，加速有机物质转化，促进微生物总量和活性的增加，进而改善土壤微生物群落结构来实现的。Janvier等[35]认为，在健康土壤中，植物病原菌受到土壤生态系统内部各种作用的制约，种群不会无限制扩大，因此不会引起植物大规模病害的暴发，与本试验的结论一致。

威廉环毛蚓和赤子爱胜蚓能有效降低西瓜枯萎病的发病率，促进植株生长。在一定范围内增加蚯蚓密度能更好地促进植物生长，降低西瓜枯萎病的发病率，并且在蚯蚓质量相同的情况下，威廉环毛蚓的防控效果优于赤子爱胜蚓。

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（責任编辑：王妮）