陈冉　彭冰　李德慧

[摘要] 目的 优化鸡骨草中生物碱的提取工艺，建立相思子碱、下箴刺桐碱的超高效液相色谱（UHPLC）测定方法。 方法 以相思子碱、下箴刺桐碱的提取量为指标，采用正交试验设计考察乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数对提取工艺的影响；色谱条件：Shim-pack XR-ODS Ⅱ色谱柱（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）；流动相：甲醇-乙腈-水-乙酸-三乙胺（6∶2∶92∶0.2∶0.3）；检测波长280 nm；流速0.4 mL/min；进样量2 μL；柱温30℃。结果 最佳提取条件为加10倍量45%乙醇，提取时间40 min，超声提取2次；相思子碱和下箴刺桐碱分别在1.49～148.80 μg/mL（r=0.9998），0.84～84.20 μg/mL（r=0.9998）范围内有良好的线性关系，加样回收率为98.9%、98.2%，RSD均<2%。 结论 本提取方法简单、快速、效率高；测定方法准确、高效；不同产地鸡骨草中相思子碱、下箴刺桐碱含量差异明显，以根部含量最多，其次为茎部，最少的部位是叶子。为鸡骨草药材的有效开发利用和质量控制提供了参考依据。

[关键词] 鸡骨草；超声提取法；相思子碱；下箴刺桐碱；超高效液相色谱；正交试验

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0145-04

[Abstract] Objective To optimize extraction technology of alkaloids in Abrus cantoniensis Hance. Establish UHPLC for the determination of abrine and hypaphorine. Methods With abrine and hypaphorine as index ingredients， orthogonal test was used to investigate the effects of ethanol concentration， solid-liquid ratio， extraction time， extraction times on extraction technology. The analysis was performed on Shim-pack XR-ODS Ⅱ column （2.0 mm×75 mm， 2.2 μm） with the mobile phase of methanol and acetonitrile - water - acetic acid - triethylamine （6∶2∶92∶0.2∶0.3） at a flow rate of 0.4 mL/min. The injection volume was 2 μL. The detection wavelength was 280 nm and the column temperature was 30 ℃. Results The optimal conditions for the extraction technology were as follows： ultrasonic extraction for two times， each time for 40 min with 10 times the amount of 45% ethanol. Abrine and hypaphorine had good linear relationship within 1.49-148.80 μg/mL （r = 0.9998）， 0.84-84.20 μg/mL （r = 0.9998）， respectively. The sample recoveries were 98.9% and 98.2% ， and RSD was less than 2%. Conclusion This extraction method was simple， rapid and high efficiency. Quantitative determination method was accurate and efficient. It had a obvious difference for contents of abrine and hypaphorine in Abrus cantoniensis Hance from different areas and different parts with root ﹥stem﹥leaf. The result provided a reference for effective development and quality control of Abrus cantoniensis Hance.

[Key words] Abrus cantoniensis Hance； Ultrasonic extraction； Abrine； Hypaphorine； UHPLC； Orthogonal test

雞骨草（Abrus cantoniens Hance）为豆科植物广州相思子，主要分布于广东、广西等南方区域，具有清热解毒、疏肝止痛之功效，对治疗急慢性肝炎、胃痛、风湿骨病、肝硬化腹水等有显著效果，是临床常用中药，许多以鸡骨草为主的制剂已作为成药上市[1-3]。研究表明[4-7]，鸡骨草含有大量的生物碱类物质，在保肝护肝、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等方面有较强的生物活性，然而目前关于鸡骨草中生物碱的提取方法有待进一步研究。相思子碱、下箴刺桐碱作为生物碱类代表性成分，具有较好的抗炎、免疫增强和抗肝损伤等作用[8-10]。超声波法利用空化效应、热效应和机械振动等作用，大大提高目标组分的提取效率、缩短提取时间，在中草药的研究中得到广泛应用[11-13]。本实验拟建立鸡骨草中相思子碱、下箴刺桐碱的超高效液相快速定量分析方法，以两者的提取量为考察指标，采用正交试验结合超声波法考察各因素对生物碱提取率的影响，优选最佳提取工艺，并分析比较不同产地和不同部位鸡骨草中相思子碱、下箴刺桐碱的含量，以期为鸡骨草的开发利用和完善鸡骨草及其产品的质量控制提供实验依据。

1 仪器与材料

鸡骨草药材分别购于广西贵港、柳州、桂林、玉林、贺州、梧州等地，由右江民族医学院药学院黄锁义教授鉴定为豆科植物广州相思子，将根、茎、叶分开，干燥后粉碎，过40目筛，保存备用。

LC-30A超高效液相色谱仪（岛津），KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA2004N型电子分析天平（上海民析精密科学仪器公司），101-3型电热鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器公司），FWl77型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），XH-100A微波催化萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）。

相思子碱对照品（百灵威，批号：LI50P81）、下箴刺桐碱对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：P26 N6F6550）；乙腈、甲醇为色谱纯，乙醇、磷酸、三乙胺为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 色谱条件 Shim-pack XR-ODS Ⅱ色谱柱（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）；流动相：甲醇-乙腈-水-乙酸-三乙胺（6∶2∶92∶0.2∶0.3）；检测波长280 nm；流速0.4 mL/min；进样量2 μL；柱温30℃。对照品和供试品溶液的色谱图，见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品相思子碱7.44 mg、下箴刺桐碱4.21 mg分别置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解、定容，配制成0.744、0.421 mg/mL的储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取贵港鸡骨草茎的粉末，精密称取1.00 g，加10 mL 45%乙醇超声提取40 min，提取功率250 W，重复提取2次，合并提取液，用45%乙醇定容，过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液，待测。

2.1.4 线性关系考察 分别吸取0.02、0.05、0.2、0.6、1.0、2.0 mL已配好的2种对照品储备液，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，得系列不同质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1.1”项下条件测定，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，得回归方程分别为Y=4127.4X-5368.9（r=0.9998），Y=4003.5X-4999.5（r=0.9997），线性范围依次为1.49～148.80，0.84～84.20 μg/mL。

2.1.5 精密度试验 取同一对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，相思子碱和下箴刺桐碱峰面积的RSD为0.88%、0.95%。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，结果相思子碱、下箴刺桐碱的峰面积的RSD为1.26%、1.31%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 精密称取6份鸡骨草，按“2.1.3”项下供试品溶液的制备方法制备，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算峰面积的RSD。结果相思子碱和下箴刺桐碱的RSD为1.69%、1.89%，表明该方法重现性良好。

2.1.8 回收率试验 精密称取6份已知相思子碱、下箴刺桐碱含量的样品，每份1.00 g，分別加入一定量相思子碱、下箴刺桐碱对照品溶液，按“2.1.3”项下供试品溶液的制备方法制备，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果相思子碱平均回收率为98.9%、RSD为1.76%，下箴刺桐碱平均回收率为98.2%、RSD为1.94%，表明该方法回收率较好。

2.1.9 进样量考察 取同一对照品溶液，分别按1.0、2.0、4.0、8.0 μL体积进样，观察相思子碱、下箴刺桐碱的色谱峰型，结果当进样体积超过2.0 μL时，峰型展宽较为严重，最终选择进样量为2.0 μL。

2.2 正交试验

在单因素试验基础上，以相思子碱、下箴刺桐碱的提取量为评价指标，选取乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数为考察因素。分别精密称取鸡骨草茎粉末1.00 g，每组试验平行3份，按正交实验L9（34）设计因素水平，见表1，试验结果和方差分析见表2～表3。

由直观分析可知，相思子碱和下箴刺桐碱的最优提取工艺分别为A3B2C3D3、A3B1C3D2。方差分析结果表明，A和D因素对相思子碱和下箴刺桐碱的提取率有显著影响，B和C因素对相思子碱影响很小，而对下箴刺桐碱的影响明显。在单因素预试验中，当D因素超过2次时，提取率变化较小，综合考虑最终确定最佳工艺组合为A3B1C3D2，即加10倍量45%的乙醇，提取时间40 min，超声提取2次。

2.3 验证试验

精密称取鸡骨草茎粉末1.00 g，按优选的工艺条件提取，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果相思子碱、下箴刺桐碱提取量的RSD为0.76%、0.83%。说明该工艺稳定性和重复性较好，操作简单。

2.4 不同提取方法效果比较

采用文献中的索氏回流法（加50倍量100%甲醇回流2 h）[14]、浸提法（加20倍量95%乙醇于20℃浸提24 h）[15]和微波辅助法（加10倍量25%甲醇于50℃，1000 r/min，300 W提取10 min）[16]，提取鸡骨草中的相思子碱、下箴刺桐碱，结果本实验方法提取效果远高于索氏回流法和浸提法，稍高于微波辅助法。虽然微波辅助法的提取时间短，但加料处理时间较长。超声法具有提取效率高、提取速度快的特点。

2.5 不同产地和不同药用部位鸡骨草中相思子碱、下箴刺桐碱含量的比较

取不同产地不同部位鸡骨草粉末，分别精密称取1.00 g，每组平行做3份，按优选的工艺条件提取，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果见表4。

由表4中数据可知，不同产地鸡骨草中相思子碱、下箴刺桐碱的含量有明显差异；相同产地不同批次也不相同，这可能是由于药材的种植方法和干燥方法不同，但总的来说，以贵港产地的含量最高。相思子碱、下箴刺桐碱的含量以根部最多，其次为茎部，叶子部分最少；且茎和叶中相思子碱的含量均远高于下箴刺桐碱的含量；而对于根部，少部分产地下箴刺桐碱的含量高于相思子碱的含量。

3 讨论

3.1 色谱方法

构建超高效液相色谱方法测定鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱，目标物在6 min内出峰，以280 nm作测定波长，不仅吸光度高，而且干扰峰少，与文献报道方法相比，建立了一种更加快速、高效、经济的分析方法[14]。

3.2 提取条件优化

乙醇因价格低廉、毒性小，被选作提取溶剂。乙醇的浓度和提取次数是影响相思子碱和下箴刺桐碱提取效率的关键因素，料液比对提取效率的影响较小，但提取液太少，不能保证药材被充分浸透，会降低提取效率。相思子碱和下箴刺桐碱分子结构中均含有叔胺基，理论上可通过向提取液中加酸，使分子中的叔胺基得质子而带电荷，增加水溶性，从而改善提取效果[17-19]。但本实验发现加各种酸均不能改善提取效果。这可能是由于分子中的叔胺基和羧基距离较近，在酸性条件下会形成分子内氢键，降低水溶性[20]。因此提取液不添加酸，最佳超声提取工艺为加10倍量45%乙醇超声提取40 min、提取2次。为鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱等生物碱类成分的提取提供一种简单、节能、高效的方法。

3.3 样品含量的测定

研究结果表明，不同产地的鸡骨草中相思子碱和下箴刺桐碱的含量差别较大，并且以根部最多，其次为茎部，最少的部分是叶子。相思子碱和下箴刺桐碱作为鸡骨草极具代表性的活性成分，可通过检测其含量为鸡骨草药材的质量控制和有效开发利用提供一定参考依据。

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（收稿日期：2016-09-16 本文编辑：王红双）