徐新蕊　单文静　吴健

[摘要] 目的 建立超高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定乌头汤中8种成分的定量方法。 方法 选用Waters Acquilty UPLC C18 column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，以乙腈-0.1%乙酸水溶液为流动相。质谱条件：电喷雾离子（ESI）源，采用多反应检测模式（MRM）对乌头汤中苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-Glu、甘草苷、甘草酸铵、麻黄碱进行定量分析。 结果 苯甲酰乌頭原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-Glu、甘草苷、甘草酸铵、麻黄碱等8种成分的线性范围分别为0.014～0.229、0.384～0.003、0.007～0.922、1.072～137.321、0.055～7.084、0.148～18.974、0.204～26.226、0.038～4.951 μg/mL，r2>0.9990，精密度相对标准偏差（RSD）分别为1.31%、1.52%、1.42%、1.56%、1.47%、1.59%、1.61%、1.57%。重复性RSD分别为2.4%、2.6%、2.7%、2.5%、3.1%、3.5%、2.3%、3.4%。回收率依次为92.68%、91.99%、92.79%、96.71%、97.19%、96.79%、98.15%、96.09%，RSD<2.15%。 结论 该方法快速、简便、重复性好，可用于同时测定乌头汤中的8种成分以及乌头汤的质量控制。

[关键词] 乌头汤；超高效液相色谱；三重四极杆质谱；多反应检测模式；质量控制

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（c）-0147-05

[Abstract] Objective To establish a quantitative method of simultaneous determination of 8 major components in Wutou Decoction by ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry. Methods Waters Acquilty UPLC C18 column （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） was selected as chromatographic column， aqueous solution of acetonitrile-1% acetic acid was taken as mobile phase. The conditions of mass spectrum： electrospray ions （ESI） source， multiple reaction monitoring （MRM） was used to take quantitative analysis of benzoylaconitine， benzoylhypaconitine， benzoylmesaconine， paeoniflorin， calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside， liquiritin， ammonium glycyrrhetate， ephedrine in Wutou Decoction. Results The linearity range of 8 major components of benzoylaconitine， benzoylhypaconitine， benzoylmesaconine， paeoniflorin， calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside， liquiritin， ammonium glycyrrhetate， ephedrine was 0.014-0.229， 0.384-0.003， 0.007-0.922， 1.072-137.321， 0.055-7.084， 0.148-18.974， 0.204-26.226， 0.038-4.951 μg/mL respectively， r2>0.9990. The relative standard deviation （RSD） of precision was 1.31%， 1.52%， 1.42%， 1.56%， 1.47%， 1.59%， 1.61%， 1.57% respectively. The repeatability of RSD was 2.4%， 2.6%， 2.7%， 2.5%， 3.1%， 3.5%， 2.3%， 3.4% respectively. The recovery rate was 92.68%， 91.99%， 92.79%， 96.71%， 97.19%， 96.79%， 98.15%， 96.09% respectively， RSD<2.15%. Conclusion This method is rapid， simple and convenient， with good repeatability， which can be used for the simultaneous determination of 8 major components in Wutou Decoction and the quality control of Wutou Decoction.

[Key words] Wutou Decoction； Ultra-high performance liquid chromatography； Triple quadrupole mass spectrometry； Multiple reaction monitoring； Quality control

乌头汤出自《金匮要略》，由制川乌、麻黄、炙甘草、白芍、黄芪组成，具有温经散寒、祛湿镇痛的功效，主治寒湿痹证[1-3]。制川乌虽是有毒之品，在临床上却广泛应用于风寒湿痹、关节疼痛、心腹冷痛、麻醉镇痛等[4-6]。国内外就乌头汤中有效成分的测定及其在治疗类风湿性关节炎的客观内在规律中进行了多层次的研究，并取得了一定的进展[7-20]，但鲜见关于乌头汤方剂质量标准或物质基础的研究报道。本研究采用超高效液相色谱法对乌头汤中8种有效成分同时进行定量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290高效液相色谱仪，Agilent 6460质谱检测器；BandelinSonorex RK 1208BH超声波清洗器（德国）；HWS 24型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；Milipore超纯水机；美国Mililpore公司METTLER Toledo AB265-S电子天平（瑞士）。

1.2 药品

甲醇、乙腈购于美国ACS恩科化学，乙酸、乙酸铵购于Sigma公司，均为色谱纯。水为超纯水，其余试剂均为分析纯。制川乌、麻黄、白芍、黄芪、炙甘草等药材购于哈尔滨人民同泰药房，经哈尔滨商业大学理学院吴健副研究员鉴定均为正品。芍药苷、甘草酸铵、甘草苷、麻黄碱、苯甲酰乌头原碱（BA）、苯甲酰次乌头原碱（BHA）、苯甲酰新乌头原碱（BMA）、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-Glu苷购于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters ACQULTY UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱进行分析，以0.01 mol/L醋酸铵溶液（含0.1%乙酸溶液）为流动相A，乙腈为B，进行梯度洗脱。0～20 min，流动相A（%）为95→80；20～30 min，流动相A（%）为80→70；30～40 min，流动相A（%）为70→50；40～50 min，流动相A（%）为50，流速为0.35 mL/min，进样量为1 μL，柱温为30℃。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI源），检测方式：正离子检测，扫描方式：多反应离子监测（MRM），对照品的选择检测离子质荷比为芍药苷：498.2→179.1；甘草酸铵：823.4→453.3；甘草苷：419.1→257.1；麻黄碱：166.0→132.8；BA：604.3→105.1；BHA：574.3→105.1；BMA：590.3→105.1；毛蕊异黄酮-7-O-β-D-Glu：447.1→285.1，干燥气（N2）流速11.0 L/min，Nebulizer 0.10335 MPa，干燥氣温度300℃，检测器电压4000 V。

2.3 对照品溶液的制备

精密取各对照品适量，分别置于量瓶中以甲醇溶解并定容，摇匀，得对照品溶液，精密吸取各对照品溶液于同一容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液。各成分含量为芍药苷137 μg/mL、甘草酸铵26.2 μg/mL、甘草苷18.9 μg/mL、麻黄碱4.96 μg/mL、BA 0.229 μg/mL、BHA 0.384 μg/mL、BMA 0.926 μg/mL、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-Glu 7.08 μg/mL。

2.4 供试品溶液的制备

按照《金匮要略》记载的乌头汤方剂配药：称取川乌6 g、黄芪9 g、麻黄9 g、甘草9 g、白芍9 g粉末，混合后以10倍量水浸泡1 h，回流提取1.5 h，取上清液，将药渣再以8倍量水提取1.5 h，合并上清液。浓缩水煎液并减压干燥，得浸膏12.1 g。取浸膏约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇10 mL，超声处理30 min，补重，滤过，取续滤液，即得。

2.5 阴性对照溶液的制备

按照“2.3”项下方法制成不含上述8种标准品的阴性样品溶液，备用。

2.6 专属性考察

按色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液进样测定，结果样品在各对照品的位置上无干扰。结果见图1～2。

2.7 线性关系的考察

精密吸取混合对照品溶液适量，依次稀释得系列质量浓度溶液。在上述色谱条件下测定，峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），进行线性回归，结果见表1。

2.8 精密度考察

精密吸取混合对照品溶液连续进样6次，记录各组色谱峰峰面积。结果BA、BHA、BMA、芍药苷、毛蕊异黄酮-7-Glu、甘草苷、甘草酸铵、麻黄碱峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.23%、1.41%、1.37%、1.38%、1.31%、1.42%、1.39%、1.26%。精密吸取混合对照品溶液连续2 d进样，每天3次，记录各组色谱峰峰面积。8种对照品峰面积的RSD分别为1.31%、1.52%、1.42%、1.56%、1.47%、1.59%、1.61%、1.57%。

2.9 重复性试验

取样品6份，按“2.4”项下配制供试品溶液。按“2.1”项下条件测定。结果BA、BHA、BMA、芍药苷、毛蕊异黄酮-7-Glu、甘草苷、甘草酸铵、麻黄碱峰面积的RSD分别为2.4%、2.6%、2.7%、2.5%、3.1%、3.5%、2.3%、3.4%（n = 6）符合试验要求。

2.10 稳定性试验

取样品，按“2.4”项下制备溶液，放置于进样室中，放置0、4、8、12、24 h，按“2.1”项下检测。结果BA、BHA、BMA、芍药苷、毛蕊异黄酮-7-Glu、甘草苷、甘草酸铵、麻黄碱峰面积的RSD分别为3.3%、2.1%、2.7%、3.2%、3.0%、2.7%、2.9%、2.5%（n = 6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.11 加样回收率试验

精密称定样品约0.5 g，加入各对照品溶液适量，按“2.4”项下制备，测定并计算回收率，结果见表2，实验结果符合中药质量标准分析方法的要求。

2.12 样品含量测定

按照“2.4”项下方法制备三批乌头汤浸膏，“2.1”项下方法检测，计算每批样品中各检测成分的含量。见表3。

3 讨论

本试验考察了不同色谱柱、流动相及质谱条件对化合物定量的影响，结果表明，Waters Acquilty UPLC C18 column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，效果较为理想，各化合物峰形良好。使用乙腈-0.1%乙酸水溶液为流动相，各化合物分离较好，无相互干扰，出峰时间短。

[参考文献]

[1] 刘伟栋，施旭光，旷永强，等.乌头汤对RA大鼠相关细胞因子影响的研究[J].中药材，2009，32（8）：1267-1269.

[2] 余翔.川乌的临床应用进展[J].中国民族民间医药，2013， 22（11）：136-137.

[3] 吴成凤，李国卫，王樟根，等.LC-MS/MS 法同时测定乌头汤中乌头碱型生物碱含[J].中药新药与临床药理，2015， 26（6）：833-837.

[4] 李玲，刘殿高，张译文，等.不同配比乌头汤组方中两种生物碱含量变化[J].医药导报，2011，30（8）：988-990.

[5] 王付.乌头汤与半夏泻心汤合方辨治关节疼痛[J].中医杂志，2016，57（6）：524-526.

[6] 王涛，林静，狄舒男，等.乌头汤及其拆方对60例寒湿型类风湿性关节炎的临床疗效观察[J].中医药学报，2016， 44（1）：85-87.

[7] 吴锦俊，程再兴，刘中秋，等.乌头汤对大鼠肝药酶 CPY3A4 活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（9）：233-236.

[8] 鄭春松，林洁，付长龙，等.基于计算机模拟乌头汤治疗疼痛的药效物质基础与分子作用机制[J].康复学报，2016， 26（1）：33-37.

[9] 陈达，陈后煌，邵翔，等.乌头汤抑制骨关节炎炎症反应的作用机制探讨[J].风湿病与关节炎，2016，5（8）：62-66.

[10] 张言，桂蜀华，谢友良，等.乌头汤不同配伍对单酯型乌头生物碱含量的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013， 19（17）：11-14.

[11] 王丹华，刘春芳，谭淑芳，等.乌头汤对大鼠的镇痛作用及初步机制探讨[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（10）：109-112.

[12] 李国卫，吴成凤，桂蜀华.配伍对乌头汤中乌头碱型生物碱的影响[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（10）：5-8.

[13] 顾向浩，陈鹏.乌头汤联合中药热敷治疗膝骨关节炎阳虚寒凝证51例疗效观察[J].湖南中医杂志，2015，31（12）：81-83.

[14] 梅罗阳，高岑，宋俊生.乌头汤及其加减方临床对照研究文献质量评价[J].河南中医，2015，35（2）：215-217.

[15] 张晓芬，王彬辉，章文红，等.HPLC测定乌头汤提取物中3种乌头类生物碱的含量[J].中国中医药科技，2012， 19（6）：510-512.

[16] 李世哲，陈瑞战，齐瑶，等.配伍禁忌半夏、贝母对乌头汤抗氧化活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013， 19（8）：198-202.

[17] 梅阳阳，付长龙，庞书勤，等.乌头汤药理药效研究及其干预骨关节炎的机制探讨[J].风湿病与关节炎，2016，5（6）：47-50.

[18] 王涛，林静，狄舒男，等.乌头汤及其拆方治疗寒湿型类风湿性关节炎临床观察[J].新中医，2016，48（8）：130-132.

[19] 梅罗阳，高岑，宋俊生.乌头汤方证临床文献研究[J].四川中医，2015，33（4）：182-184.

[20] 辛杨，刘志强，刘淑莹.ESI-MS研究反药配伍对乌头汤肠内菌代谢的影响[J].中药材，2015，38（8）：1728-1731.

（收稿日期：2016-10-09 本文编辑：张瑜杰）