王贤 林涛发 詹志瑜 王少扬

NKG2D是NK细胞、NKT细胞及部分活化CD8+T淋巴细胞表面的一种复合体型强效活化受体，在乙肝免疫发病机制中起重要作用[1-2]。为了更深入了解NKG2D介导NK细胞活化在HBV感染免疫病理损伤中的作用，以及T淋巴细胞亚群的表达特征。本研究对不同免疫状态慢性HBV感染者的血清NKG2D水平进行了测定和对照分析，现报道如下。

对象与方法

一、研究对象

研究对象为联勤保障部队第九〇〇医院从2017年1月至2018年12月接诊的80例慢性HBV感染患者及30名健康体检者。慢性HBV感染患者中男性45例，女性35例，年龄20～62岁，平均年龄(36. 1±4.6)岁；健康体检者男性16名，女性14名，年龄18～64岁，平均年龄(35.6±5.0)岁。慢性HBV感染者根据免疫状态的不同分为免疫耐受组(28例)、免疫清除组(30例)、低(非)复制组(22例)，健康体检者纳入对照组。入组对象均对本次研究知情了解，自愿参与研究并签署了知情同意书。本研究通过了本院医学伦理委员会批准。

纳入标准：①年龄18～65岁；②慢性HBV感染者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[3]的诊断及分型标准。排除标准：①感染其他肝炎病毒者(如HAV、HCV、HEV等)；②合并脂肪性、免疫性、代谢性、药物性肝病者；③处于哺乳期或妊娠期者；④病毒感染史不明确者；⑤已发展为肝硬化或肝癌者；⑥合并严重心脑肾肺功能障碍者。

二、方法

1.肝功能检测：采集患者的空腹静脉血，使用Olympus AU640全自动生化仪进行肝功能检测。肝功能指标包括ALT、总胆红素(TBil)、白蛋白。

2.HBV血清标记物检测：仪器选用ANYTEST 2000时间分辨仪(上海新波生物技术有限公司生产)，采用时间分辨荧光分析法测定HBV血清标志物，包括HBeAg、HBsAg、抗-HBc、抗-HBe。

3.HBV DNA定量检测：仪器选用OpticonMonitor实时荧光定量PCR仪(美国MJResearch公司生产)，检测方法采用实时荧光探针定量-聚合酶链反应。

4.外周血淋巴细胞亚群检测：常规采集静脉外周血，仪器选用EPICS-XL流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司生产)，试剂为四色淋巴细胞亚群试剂，检测方法为四色荧光标记流式细胞术。检测内容包括CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞及NKG2D+/NK细胞百分比。在5支流式细胞检测计数管中分别加入20 μL的CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞或NKG2D+/NK荧光标记抗体，然后加入混合均匀的抗凝全血50 μL，涡旋混匀15 s，室温避光孵育15 min，然后加入450 μL溶血素，充分振荡混合均匀，室温避光孵育15 min，然后使用流式细胞仪进行检测。NKG2D+/NK细胞百分比：测定NK细胞占总淋巴细胞百分率，再以NPC-NKG2D标记抗体(美国BioLegend公司生产)计数NK细胞群中NKG2D+NK细胞百分率及平均荧光强度。利用EXPO2分析软件进行补偿调节，以获取细胞频数及图像。

5.血清TNF-α、γ干扰素检测：采用酶联免疫吸附法测定外周血中TNF-α、γ干扰素水平，试剂盒均由美国R&D公司提供，严格按照试剂盒操作说明书进行检测。检测步骤：对血液标本进行高速离心后，保留血清待检。准备试剂、样品及标准品，设置对照孔、标准孔、待测样品孔。在标准品酶标抗体微孔板上加入50 μL标准品，待测样品酶标抗体微孔板上加入40 μL待测样品稀释液，再加入10 μL待测样品液。所有微孔板使用封板模进行处理，37℃孵育30 min。拆除微孔板表面的封板膜，并移除表面液体，风干。在微孔板中加入洗涤液，30 s后移除表面洗涤液，重复5次，风干。在标准孔及待测样品孔中各加入50 μL酶标试剂液，37℃孵育30 min，洗涤，然后在各微孔板中先后加入50 μL的A显色剂和B显色剂，振荡均匀，避光静置显色10 min。向各微孔板加入50 μL终止液以终止反应，最后使用450 nm波长的酶标仪对微孔板的吸光度进行测量。绘制吸光度标准曲线，计算出相应浓度，并乘以相应稀释倍数，最终获得实际样品浓度。

三、统计学方法

结 果

一、T细胞、NK细胞、NKG2D+/NK细胞百分比

4组研究对象的CD3+T淋巴细胞百分比接近，差异无统计学意义(P>0.05)。CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+、NK细胞、NKG2D+/NK细胞百分比比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；免疫清除组的CD4+T淋巴细胞、CD4+/CD8+、NK细胞百分比均显著低于另外3组，CD8+T淋巴细胞、NKG2D+/NK细胞百分比均显著高于另外3组(P<0.05)。与对照组相比，免疫耐受组、免疫清除组、低(非)复制组的CD4+T淋巴细胞、CD4+/CD8+水平明显更低，CD8+T淋巴细胞水平明显更高(P<0.05)。免疫耐受组和低(非)复制组的NKG2D+/NK细胞百分比均显著低于对照组，免疫清除组的NKG2D+/NK细胞百分比显著高于对照组(P<0.05)。免疫耐受组、低(非)复制组、对照组的NK细胞水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

二、血清TNF-α、γ干扰素水平

4组研究对象的血清TNF-α、γ干扰素水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；免疫清除组的TNF-α、γ干扰素水平均显著高于免疫耐受组、低(非)复制组及对照组(P<0.05)。免疫耐受组、低(非)复制组及对照组的TNF-α、γ干扰素水平比较，差异均无统计意义(P>0.05)。见表2。

表2 4组研究对象血清TNF-α、γ干扰素水平比较(ng/L，±s)

注：*与对照组比较，#与免疫清除组比较，P<0.05

讨 论

正常状态下，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞相互制约、相互协作，并始终维持在平衡状态。临床经常通过CD4+/CD8+来判定机体的免疫平衡状态，其比值是机体细胞免疫功能状态的直接反映[4-5]。本研究结果显示，与对照组相比，免疫耐受组、免疫清除组、低(非)复制组的CD4+T淋巴细胞、CD4+/CD8+水平明显更低，CD8+T淋巴细胞水平明显更高，说明HBV感染对机体的细胞免疫功能造成了明显影响。免疫清除组的CD4+T淋巴细胞、CD4+/CD8+百分比均显著低于另外3组，CD8+T淋巴细胞百分比均显著高于另外3组；与文献报道结论相符[6-7]。这表明慢性HBV感染会对CD4+T淋巴细胞造成破坏，降低CD4+T淋巴细胞水平，造成体内特异性抗体生成不足。同时，HBV感染还会造成CD8+T淋巴细胞寡克隆增加，大量的CD8+T淋巴细胞会对CD4+T淋巴细胞产生抑制作用，进而进一步降低CD4+T淋巴细胞的病毒清除能力[8]。

本研究结果显示，免疫清除组的血清NK细胞百分比明显比免疫耐受组和低(非)复制组更低。这提示NK细胞可能参与了慢性HBV感染免疫耐受打破、HBV复制抑制与抗病毒免疫过程。免疫清除阶段外周血NK细胞的减少，可能是因为该时期的肝细胞损伤明显，肝外大量的NK细胞被趋化至肝脏发挥免疫调控，或者介导肝细胞免疫损伤作用，所以外周血中的NK细胞数会明显减少[9]。王亚东等报道[10]，阻断NKG2D表达能够使肝组织的炎性损伤程度显著减轻，这表明NKG2D可能是NK细胞发挥靶向杀伤效应的一个重要途径，G2D表达上调可激活NK细胞，从而在HBV致肝损伤中发挥独特作用。本研究结果显示，免疫清除组的NKG2D+/NK细胞百分比显著高于免疫耐受组和低(非)复制组。这表明NKG2D的过度表达与活化，能够促进NK细胞发挥靶细胞毒性效应，诱发肝组织的病理性损伤。结果还显示，免疫耐受组和低(非)复制组的NKG2D+/NK细胞百分比均显著低于对照组。这可能是因为处于免疫耐受期及非活动期的HBV携带者，受自身调控机制及病毒的影响，NK细胞活化性受体得到了有效抑制，使机体能够维持对HBV感染后的免疫耐受或免疫不全状态，所以这两个免疫时期HBV感染患者的NKG2D+/NK细胞百分比更低，甚至可能比健康人群更低[11-13]。本研究结果还显示，免疫清除组伴随着HBV DNA和NKG2D+/NK细胞百分比的降低，TNF-α、γ干扰素水平明显升高。提示NKG2D表达会对NK细胞合成、分泌TNF-α、γ干扰素等效应分子产生重要作用。血清TNF-α、γ干扰素水平的升高提示肝脏炎症损伤明显，相比免疫耐受期和非活动期HBV感染者，处于免疫清除期的HBV感染者肝脏损伤更为严重，所以其血清TNF-α、γ干扰素水平明显更高[14-15]。

表1 4组研究 对象的T淋巴细胞、NK细胞、NKG2D+ /NK细胞百分比(%，±s)

注：*与对照组比较；#与免疫清除组比较，P<0.05

综上所述，慢性HBV感染患者在不同免疫状态下，外周血T淋巴细胞、NK细胞及NKG2D细胞表达有明显差异，降低NKG2D能够强化免疫以促进病毒排除，同时还能够还能抑制NK细胞介导的免疫炎性损伤，减轻肝功能损伤。可通过测定HBV感染者外周血T淋巴细胞、NKG2D细胞水平来评估患者的免疫状态，指导临床治疗。