张军建 张矿召

研究表明，HCV NS3蛋白与HCV相关的肝细胞癌的发生有密切关系[1],但其确切机制尚不明确。端粒酶(telomerase)的激活是细胞恶变和异常增殖的标志，HCV NS3蛋白可以激活肝癌细胞HepG2细胞的端粒酶活性，可能是细胞恶性转化的原因之一[2]。本研究构建了稳定表达HCV NS3蛋白的人正常肝细胞模型，用于研究HCV NS3基因对人正常肝细胞的增殖情况以及对端粒酶的影响。

材料与方法

一、材料

(一)细胞株、质粒和菌株 人正常肝细胞株L02购自中国科学院细胞库，质粒pcDNA3.1(+)与大肠埃希菌菌株DH5a感受态细胞购自Thermo Fisher Scientific 公司，用于目的基因的插入和扩增。

(二)酶与试剂 胎牛血清、胰酶、G418、1640培养基和脂质体Lipofectamine2000系美国Invitrogen公司产品；限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ购自MBI 公司；T4 DNA 连接酶购自大连宝生物公司；Qiagen Plasmid Midi 试剂盒质粒抽提试剂盒购自Qiagen 公司；PCR 试剂盒、RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒、DNA 分子质量标记均为Thermo Fisher Scientific 公司产品；MTT为Amresco公司产品； HCV NS3 单克隆抗体(MA1-21376)购自美国Invitrogen公司；端粒酶检测试剂盒(Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA)购自德国Roche公司。

二、方法

(一)质粒构建 以HCV基因亚型2a的JFH1病毒株为HCV NS3扩增模板，利用软件设计PCR 引物，引物两端分别加上Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位点。PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并回收目的片段进行序列测定确认PCR 扩增无误。分别对鉴定后的HCV NS3平端基因片段和pcDNA3.1(+)用内切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ进行双酶切，并用T4连接酶连接，转化至E. coli DH5α感受态细胞，挑取克隆进行测序鉴定。鉴定后的阳性克隆进行扩大培养，并将pcDNA3.1(+)/HCV NS3质粒用试剂盒提取和纯化。

(二)稳定转染细胞的培养 细胞转染按照Lipofectamine2000说明书操作。……