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(1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院,吉林长春 130117;2.延边朝鲜族民族医医院,吉林延边 133000)

血红铆钉菇(Chroogomphusrutilus(Schaeff.)O.K. Mill.)属于担子菌亚门牛肝菌目铆钉菇科铆钉菇属,是东北地区珍贵的野生食用菌,俗称松蘑、红蘑、松树伞等[1]。是一种与松树共生的外生菌根性真菌[2],营养价值极高,深受人们喜爱。血红铆钉菇味平性甘,具有清热解毒,健脾益胃等功效[3]。

现代研究发现,血红铆钉菇含有多糖、蛋白质、香豆素、酚类、甾醇、脂肪酸等多种成分[4]。高婵娟[5]从血红铆钉菇中分离得到GRMPW、GRMPS两种水溶性多糖,结构表征分析表明GRMPW、GRMPS均由葡萄糖和木糖按不同比例组成。杨雪[6]对血红铆钉菇总黄酮提取、纯化,并通用波谱进行分析,结果表明,优化后总黄酮提取率为6.72%,其主要成分为黄芩苷。罗杰[7]采用多种色谱分离方法,从血红铆钉菇二氯甲烷层中分离出39个化合物,主要为甾醇、酚类、核苷等成分。李贞卓[8]利用GC-MS对石油醚层提取物进行分析,结果鉴定出8种物质,以亚油酸、十八碳烯酸等不饱和脂肪酸为主。但目前关于血红铆钉菇的成分测定分析研究较少,无法对血红铆钉菇子实体的质量进行控制。

麦角甾醇作为食用真菌中特征甾醇,具有抗炎、抗肿瘤、抑制胆固醇[9]的吸收等多种药理活性,可作为食用真菌生物量的重要指标[10]。黄酮、酚酸类化合物广泛存在于食用菌中,是其发挥抗氧、抗肿瘤、抗炎等作用的重要物质基础[11-12]。为全面反映血红铆钉菇子实体的质量,评价不同产地之间的差异性,本研究采用多指标、多手段进行综合性评价,建立新的HPLC方法测定血红铆钉菇中麦角甾醇的含量,同时在采用紫外分光光度法测定总黄酮、总酚酸的含量。目前指纹图谱技术在食用菌的鉴别、质量控制等方面应用越来越广泛,能够全面体现食用菌有效成分的整体性、稳定性,以及不同产地间的共有性图谱片段[13-14]。因此,继续建立了10批不同产地血红铆钉菇的指纹图谱,通过聚类分析,拟从整体上评价血红铆钉菇子实体的质量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

药材 于2018年9月中旬采集于吉林省延边朝鲜族自治州,经长春中医药大学张辉教授鉴定为血红铆钉菇(Chroogomphusrutilus(Schaeff.)O.K.Mill.)的干燥子实体,药材来源见表1;乙腈 色谱纯,美国Fisher公司;三氟乙酸(Trifluoroacetic Acid,TFA) 色谱纯,北京百灵威公司;十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS) Sigma-Aldrich公司;槲皮素、没食子酸 中国食品药品检定研究院(纯度均≥98%),批号100081-200907、110831-20080;麦角甾醇 实验室分离自制(纯度>95%);其他试剂 均为国产分析纯。

表1 血红铆钉菇药材来源Table 1 Origins of Chroogomphus rutilus

Agilent1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司;SPECORD200PLUS紫外可见分光光度计 德国ANALYTIKJENA公司;WP-UP-III-40超纯水机 四川Water Purifier公司;BP211D电子天平 德国Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液的制备 取粉碎后血红铆钉菇子实体粗粉2.0 g,置100 mL锥形瓶中,加50 mL甲醇,称重,超声(功率100 W)1 h,放冷,再次称重,补足重量,过滤,滤液水浴蒸干,加甲醇溶解,定容到25 mL的量瓶中,即得。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取麦角甾醇、槲皮素、没食子酸对照品,加入甲醇溶解,分别配制成0.104、0.540、0.204 mg/mL的对照品溶液。

1.2.3 色谱条件 Aglient Eclipse plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);检测波长282 nm;柱温25;进样量10 μL;流动相乙腈(A)-0.1% TFA水,流动相条件0～7 min:30%～70% A;7～20 min:70%～85% A;20～25 min:85%～92% A;25～50 min:92%～100% A;50～60 min:100% A;60～65 min:100%～30% A;65～75 min:30% A;流速1.0 mL/min。

1.2.4 麦角甾醇含量测定

1.2.4.1 标准曲线的绘制 分别精密量取麦角甾醇对照品溶液4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL按1.2.3项下条件进行测定[15]。将麦角甾醇的质量作为横坐标(X),将峰面积值作为纵坐标(Y),绘制标准曲线。

1.2.4.2 样品含量测定 10批不同产地的血红铆钉菇根据1.2.1项下方法制备样品溶液,运用1.2.3项下色谱条件分析,计算麦角甾醇的含量。

1.2.5 总黄酮含量测定

1.2.5.1 标准曲线的绘制 分别取槲皮素对照品溶液0、50、100、200、300、400 μL至10 mL比色管中,加70%乙醇至5 mL,加入5% NaNO20.3 mL,摇匀,静置6 min,再加10% Al(NO3)30.3 mL,摇匀,静置6 min,再加4% NaOH 2 mL,用70%乙醇定容到10 mL,摇匀,静置6 min,于510 nm波长下测吸光度[16-17]。以槲皮素的浓度为横坐标(X),吸光度为纵坐标(Y),绘制标准曲线。

1.2.5.2 样品含量测定 移取样品溶液0.2～10 mL比色管中,按1.2.5.1项下方法测定,计算总黄酮的含量。

1.2.6 总酚酸含量测定

表2 麦角甾醇加样回收率实验结果Table 2 Results of the recovery test for ergosterol

1.2.6.1 标准曲线的绘制 采用K3[Fe(CN)6]-FeCl3显色体系进行显色分析[18],分别取没食子酸对照品溶液0、100、200、250、300、400 μL至10 mL比色管中,加无水乙醇至5 mL,静置5 min,加0.3% SDS 2 mL,再加0.6% FeCl3-0.9% K3[Fe(CN)6](1∶1)1 mL,避光静置6 min,用0.1 mmol/L定容到10 mL,摇匀,避光放置30 min,于733 nm下测吸光度。以没食子酸的浓度作为横坐标(X),吸光度作为纵坐标(Y),绘制标准曲线。

1.2.6.2 样品含量测定 移取样品溶液0.2～10 mL比色管中,按1.2.6.1项下方法测定,计算总黄酮的含量。

1.2.7 不同产地血红铆钉菇HPLC指纹图谱的建立 取10批不同产地的血红铆钉菇样品溶液,运用1.2.3项下色谱条件测定。将10批血红铆钉菇的HPLC数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版A”进行分析[19]。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0软件,对不同产地血红铆钉菇的含量差异性进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 麦角甾醇含量测定方法学验证

2.1.1.1 标准曲线 按1.2.4.1项下方法进行标准曲线绘制,得回归方程为Y=936859X+9.2889,R2=0.9999,结果表明进样量分别在0.416～2.08 μg范围内呈现良好的线性关系。

2.1.1.2 方法学验证 取麦角甾醇对照品溶液10 μL,连续进样6次,结果显示麦角甾醇含量的RSD为0.85%,说明仪器精密度高;取1号血红铆钉菇样品,按1.2.1项下方法制备6份溶液,分别进样分析,结果显示,麦角甾醇含量的RSD为1.44%,说明该方法重复性好;取1号血红铆钉菇溶液,分别在制备0、2、4、8、16、24 h后进样分析,结果显示,麦角甾醇含量的RSD为2.92%,表明样品在制备24 h内稳定性好;取1号血红铆钉菇样品加入一定量的麦角甾醇对照品溶液,根据1.2.1项下方法制备样品,并根据1.2.3项下方法进行分析,结果见表2,加样回收率在98.22%～103.97%,RSD为2.18%,表明试验方法有较好的回收率,回收结果准确可靠。

2.1.2 总黄酮含量测定方法学验证

2.1.2.1 标准曲线 按1.2.5.1项下方法进行标准曲线绘制,得线性回归方程Y=7.0943X+0.3623,R2=0.9996,结果表明槲皮素溶液浓度为2.7～21.6 μg/mL时,其与吸光度呈良好线性关系。

2.1.2.2 方法学验证 取1号血红铆钉菇样品,按1.2.1项下方法制备溶液,连续测定6次[20-22],结果显示,总黄酮含量的RSD为0.89%,说明仪器精密度高。取1号血红铆钉菇样品6份,根据1.2.1项下方法制备溶液,测定A值[20-22],结果显示,总黄酮的含量的RSD为1.85%,说明方法重复性良好。取1号血红铆钉菇溶液,分别在制备0、20、40、60、80、120 min后测定[20-22],结果显示,总黄酮含量的RSD为2.57%,表明制备的样品在120 min内稳定性好。

2.1.3 总酚酸含量测定方法学验证

2.1.3.1 标准曲线 按1.2.6.1项下方法进行标准曲线绘制,得线性回归方程Y=46.075X+0.4176,R2=0.9990,结果表明没食子酸溶液浓度为2.04～8.16 μg/mL时,其与吸光度呈良好线性关系。

2.1.3.2 方法学验证 取1号血红铆钉菇样品,按1.2.1项下方法制备溶液,连续测定6次[20-22],结果显示,总酚酸含量的RSD为0.40%,表明仪器精密度高。取1号血红铆钉菇样品6份,按1.2.1项下方法制备溶液,测定A值[20-22],结果显示,总酚酸的含量的RSD为0.52%,说明方法重复性良好。取1号血红铆钉菇溶液,分别在制备0、20、40、60、80、120 min后测定[20-22],结果显示,总酚酸的含量的RSD为2.06%,说明制备的样品120 min内稳定性好。

2.2 不同产地血红铆钉菇主要成分含量

结果显示,不同产地血红铆钉菇的主要成分含量存在差异。10批血红铆钉菇样品中,麦角甾醇含量为(1.82±0.02)～(2.14±0.03) mg/g,总黄酮含量为(4.62±0.14)～(10.35±0.13) mg/g,总酚酸含量为(6.73±0.06)～(9.27±0.06) mg/g。麦角甾醇含量最高的是2号(龙井东山),为(2.14±0.03) mg/g,显著高于其他产地的样品(P<0.05);总黄酮含量最高的要1号(延吉延东村),为(10.35±0.13) mg/g,显著高于其他产地的样品(P<0.05);总酚酸含量最高的是4号(汪清长兴村),为(9.27±0.067) mg/g,显著高于其他产地的样品(P<0.05)。

表3 不同产地血红铆钉菇主要成分含量(mg/g dw)Table 3 Content of main chemical compositions of Chroogomphus rutilus produced from different areas(mg/g dw)

注:表中数值以平均值±标准偏差表示(n=3),同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 HPLC指纹图谱的建立及分析

2.3.1 指纹图谱的建立 通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版A”的分析,得到10批不同产地血红铆钉菇的HPLC指纹图谱及对照图谱(图1)。

表4 不同血红铆钉菇样品的相似度评价Table 4 Similarity evaluation of different kinds of Chroogomphus rutilus samples

图1 不同血红铆钉菇样品的 HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of different kinds of Chroogomphus rutilus samples

2.3.2 相似度评价 以血红铆钉菇的HPLC对照指纹图谱为对照,进行整体相似度评价[23]。结果显示,10批血红铆钉菇的相似度均在0.994以上(表4),表明各不同产地血红铆钉菇的化学成分一致性较好,均含有10个成分,但各成分含量存在差异。

2.3.3 共有峰的指认及相关分析 通过分析生成的共有模式图,确定了血红铆钉菇HPLC指纹图谱中10个色谱峰为共有峰[22],其中6号色谱峰的保留时间适中、分离效果较好,因此选6号峰为参比峰,同时经对照品比对,确定10号峰为麦角甾醇。共有模式图中10个共有峰的相对保留时间(相对峰面积)分别为0.314(0.087),0.571(0.137),0.686(3.570),0.734(0.100),0.788(0.260),1.000(1.000),1.182(0.280),1.526(0.301),1.638(0.192),1.931(0.524)。

图2 麦角甾醇对照品HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of ergosterol substance control

图3 血红铆钉菇HPLC图谱的共有模式图Fig.3 The common pattern of HPLC fingerprint of Chroogomphus rutilus

2.3.4 指纹图谱方法学验证 取1号血红铆钉菇溶液,连续6次进样[24],结果见表5,10个共有峰的相对保留时间的RSD均<1%、相对峰面积RSD均<2%,说明该仪器的精密度较好。取1号血红铆钉菇样品,按1.2.1项下方法制备6份溶液,分别进样[24],结果见表6,10个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%,说明方法重复性良好;取1号血红铆钉菇溶液,分别在制备0、2、4、8、16、24 h后进样[24],结果见表7,10个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3%,说明样品在制备24 h内稳定性好。

表5 指纹图谱精密度实验结果Table 5 Experimental results of fingerprint precision

注:表中数据为相对保留时间/相对峰面积;表6、表7同。

表6 指纹图谱重复性实验结果Table 6 Experimental results of fingerprint repeatability

表7 指纹图谱稳定性实验结果Table 7 Experimental results of fingerprint stability

2.4 聚类分析

根据10批不同产地血红铆钉菇的10个共有峰的峰面积,经SPSS 20.0处理,得到聚类分析图(图4)。根据聚类分析结果,将10批样品分为2类,其中S3和龙头道、S7和龙青龙以及S10珲春松洞为归为一类;S1延吉延东村、S2龙井东山、S4汪清长兴村、S5图门四方粒子、S6龙井黄记沟、S8和龙小和龙、S9延吉九龙归为一类。该结果与相似度评价结果较为一致。血红铆钉菇主要成分含量基本按照高经度向低经度聚集、高纬度向低纬度聚集的规律,只有珲春松洞产地的血红铆钉菇表现不同,是地名记录有误、GPS定位有误、还是客观属性有待进一步分析。

表8 不同产地血红铆钉菇指纹图谱的共有峰面积Table 8 Common peak areas of fingerprints of different kinds of Chroogomphus rutilus samples

图4 不同产地血红铆钉菇样品的综合聚类分析Fig.4 Comprehensive clustering analysis of different kinds of Chroogomphus rutilus samples

3 结论

本文建立新的HPLC方法完成了血红铆钉菇中麦角甾醇的含量测定,经验证,该方法稳定、可控,同时各主要峰有良好的分离度。为了更加全面、科学、合理评价血红铆钉菇的质量,因此采用多指标评价,在测定麦角甾醇含量的基础上增加了总黄酮、总酚酸的含量测定。分析结果显示,10批不同产地血红铆钉菇样品中麦角甾醇、总黄酮、总酚酸的含量存在显著差异(P<0.05),麦角甾醇、总黄酮和总酚酸含量最高的样品分别来自于龙井东山、汪清长兴村和延吉延东村,而延吉九龙样品中麦角甾醇的含量最低,珲春松洞的样品总黄酮含量最低,来自和龙头道的样品总酚酸含量最低。

多指标评价和指纹图谱与相结合的方法可以更加全面评价血红铆钉菇子实体的质量,提高了血红铆钉菇的稳定性和一致性。本研究所建立的不同产地血红铆钉菇子实体的HPLC指纹图谱,可反映样品的特异性和整体性信息。在比较相对保留时间后,确定10个色谱峰是共有峰,指认了10号峰为麦角甾醇。10批血红铆钉菇的相似度评价结果表明,各产地的相似度均在0.994以上,表明各不同产地血红铆钉菇样品的化学成分一致性较好,均含有10个成分,但各成分含量存在差异。聚类分析结果表明,不同产地血红铆钉菇分为两大类,其中和龙头道、龙青龙以及珲春松洞为一类,其他产地为一类,血红铆钉菇质量基本按照高经度向低经度聚集、高纬度向低纬度聚集的基本规律。但同时因样本量太少、分布范围不够广泛、采摘之后的干燥,储藏信息不完善等因素,导致产地划分可能不是很明确。通过本研究可以确定采用高效液相色谱法建立血红铆钉菇子实体指纹图谱是可行,为血红铆钉菇子实体指纹图谱的进一步研究奠定基础。下一步将扩大样本量,完善样本信息,通过HPLC-MS等手段,定性分析其他共有峰,同时采用主成分分析研究各共有峰对血红铆钉菇指纹图谱差异的贡献值[25]。