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(1.重庆市中药研究院,重庆 400065;2.重庆市中药健康学重点实验室,重庆 400065)

梁平柚又名梁山柚,属于文旦柚的一种,清乾隆末期由福建省引入,在重庆梁平已有200多年栽培历史。梁平柚果高肩平顶,果形美观,色泽橙黄,皮薄光滑,油胞较细,果皮芳香浓郁,是中国柚类平顶型柚的代表品种[1]。梁平柚果皮约占柚子鲜重的五分之一,其中外果皮约占柚子鲜重的9%,富含芳香性挥发性成分。与其它柚皮精油相似,梁平柚果皮精油不但具有柑橘类水果的芳香味,还拥有独特的柚香味,具有祛痰、止咳、促进消化、镇痛、抗菌消炎等作用[2-4],作为一种天然香料广泛应用于食品、药品和化妆品等行业。

国内外学者对柚皮精油进行了深入研究,其中一些研究表明不同产区、不同品种和不同提取方法制备的柚皮精油在品质方面存在一定的差异。洪鹏等[5]采用GC-MS法对琯溪蜜柚、沙田柚和梁平柚三种柚皮精油对比研究发现:三种柚子精油的主要成分均为d-柠檬烯(476.150～741.595 μg/mL)、β-月桂烯(13.859～207.255 μg/mL),但琯溪蜜柚精油含有更高浓度的β-月桂烯,沉香醇以及醛类成分;张浩等[6]以沙田柚为研究对象,研究采用冷压榨、水蒸汽蒸馏及机械磨皮三种方法制备的柚皮精油挥发性成分差异性,研究发现:冷榨油的萜烯类、醛类、酯类组分的相对含量高于水提油和磨皮油,冷压油对柚皮精油的呈香成分保留率更高;原鲜玲等[7]对广西容县、广西桂林、广西融水和福建4地沙田柚柚皮挥发性成分进行检测,发现不同产地柚果皮挥发油中有7个共有成分,但各成分含量在不同产地的柚果皮挥发油中有一定差别。经多年田间观察发现,在梁平柚主产区同一果园内不同树龄柚皮精油的感官评价存在明显差异性,但目前关于树龄对梁平柚果皮精油挥发性成分组成影响的研究鲜见报道。

本研究以不同树龄梁平柚果皮精油为研究对象,采用顶空固相微萃取法(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)萃取柚皮精油挥发性成分,结合气相色谱质谱联用法(Gas chromatography-Mass spectrometry,GC-MS)分析其组成,并运用偏最小二乘法判别法(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和凝聚层级聚类法(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)两种统计分析方法对其进行组分差异分析,以期为梁平柚果皮精油差异化开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试的梁平柚果 均来自重庆市梁平区合兴镇龙滩村万亩名柚园,分别选取土壤类型、地势地貌、管理水平及树冠内密度等基本一致,树龄分别为7～10、11～15、16～20、21～30和30年以上的梁平柚树,每个树龄随机挑选10棵树,分别从每棵树中间冠层外围采集1个果实,每个树龄采集10个,所选果实大小一致、无病害且成熟度相似。依次将5个树龄段柚果设为N1、N2、N3、N4、N5组,每组10个样品,分别为1～10号样为N1组,11～20号样为N2组,21～30号样为N3组,31～40号样为N4组,41～50号样为N5组。果实无损运回实验室后,于4 ℃保存至使用;正构烷烃标准品(C6～C20) 美国Sigma公司;氯化钠(分析纯) 重庆川东化工(集团)有限公司。

Agilent TD-GC/MS(7890A-5975C)型气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司;57330-U SPME手柄、75 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取纤维头 美国SUPELCO公司;顶空萃取瓶 济南赛畅科学仪器有限公司;HJ-A4型数显恒温搅拌水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 顶空固相微萃取样品制备 将剔去白皮层的柚皮切成2 mm的方块,准确称取0.5 g,置于20 mL顶空萃取瓶中,加入3 mL纯水,于高速分散器中处理2 min,加入1.05 g NaCl固体(形成NaCl饱和溶液),用聚四氟乙烯隔垫密封,于80 ℃水浴中平衡20 min后。将萃取头插入250 ℃的GC进样口老化20 min,然后插入经过平衡的装有样品的顶空萃取瓶中,于80 ℃下吸附40 min;再将萃取头插入GC进样口,250 ℃解吸5 min。

1.2.2 GC-MS分析条件 色谱条件:色谱柱为RTX-5MS毛细管柱(60 m×0.32 mm×0.25μm);载气为He,流速1 mL/min,分离比5∶1;进样温度为250 ℃;升温程序为起始温度为40 ℃,保持5 min,以8 ℃/min,升至250 ℃,保持5 min。

质谱条件:EI电离源,能量70 eV;离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,接口温度250 ℃,扫描范围30～500 m/z。

1.3 数据处理

柚皮精油挥发性物质利用GC-MS 联用仪进行鉴定,并根据C6～C20正构烷烃的保留时间计算各个色谱峰的保留指数,利用NIST08标准谱库进行初步检索,选取相似度大于80%的挥发性成分,并结合相关文献[8-13]的保留指数对比进行定性分析,通过色谱峰面积归一化法计算得各挥发性成分在不同样品精油中的相对含量;应用Excel 2007进行数据收集和整理,利用SIMCA-P 14.0对5种不同树龄梁平柚果皮精油中的挥发性成分进行PLS-DA和HCA分析。

2 结果与讨论

2.1 不同树龄梁平柚皮挥发性成分分析

通过GC-MS检测分析,得到5种不同树龄梁平柚果皮精油挥发性成分的总离子流色谱图,由图1可知,本试验所使用的GC-MS条件能较好分离各挥发性成分,其差异主要出现在检测时的5～30 min时间段。

图1 不同树龄梁平柚果皮精油 挥发性成分纵向叠加总离子流色谱图Fig.1 Overlapped total ion current chromatograms of volatile components in peel of Liangping pomelo with different tree ages

5种不同树龄梁平柚果皮精油中共分离检测到72种挥发性化学成分,利用质谱信息与标准谱库NIST08分别对各色谱峰进行初步检索及相关文献参考定性,确认挥发性物质名称,其分析结果见表1。如表1所示,5种不同树龄梁平柚果皮精油的挥发性成分中有8种成分较高(相对含量>1%),分别为d-柠檬烯(49.93%～54.93%)、β-月桂烯(18.55%～20.79%)、大根香叶烯 D(2.16%～3.66%)、桧烯(1.53%～3.20%)、β-蒎烯(1.33%～2.80%)、柠檬醛(2.52%～2.73%)、E-β-罗勒烯(1.49%～2.46%)、圆柚酮(1.01%～2.14%),共占总挥发性成分的83.40%～87.61%。本试验检测出的d-柠檬烯和β-月桂烯相对含量与洪鹏等[5]的研究结果具有较大差异,洪鹏等通过挤压法制备的梁平柚精油挥发性成分中d-柠檬烯为74.16%和β-月桂烯为13.86%,这种差异可能来源于实验柚果成熟度的差异或柚皮精油制备工艺的不同[14]。

表1 不同树龄梁平柚果皮挥发性成分及相对含量Table 1 Volatile components and relative contents in peel of Liangping pomelo with different tree ages

续表

注:“-”为参考文献[8-13]中未报道,同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

相关研究表明[15-17],柚皮精油的挥发性成分中d-柠檬烯、β-月桂烯、圆柚酮、α-蒎烯、β-蒎烯和芳樟醇为其主要香味成分。由表1可以看出,d-柠檬烯在不同树龄梁平柚果皮精油中的相对含量较稳定,无显著差异性(P>0.05);N5组β-月桂烯相对含量(20.79%)显著大于N1组(18.55%)(P<0.05),N2、N3和N4组无显著差异(P>0.05),表明树龄越大,柚皮的香甜脂气味[18]越浓;圆柚酮能提供强烈的柚子橙子果香味[5],N4组中圆柚酮相对含量最高(2.14%),与其他测试组差异显著(P<0.05);α-蒎烯和β-蒎烯具有松节油香味[3],在N1组中相对含量最高,分别为2.50%和2.80%,2种成分的相对含量随树龄的增长,均呈逐渐减少趋势;芳樟醇具有花香、果香和浓郁草香味[3],在N1组中相对含量最高(2.22%),随树龄的增长其逐渐减少。

同时由表1可以看出,随着树龄的增长,柚皮精油挥发性成分中保留指数大于2000的挥发性成分相对含量逐渐增加,由N1的0.01%增长到N5的0.39%,孙浩等[9]研究发现,这类成分在常温下难以挥发,对香气几乎没有影响,但对柚皮精油的透明度和澄清度有负面影响,造成精油稳定性降低。由此可见,不同树龄梁平柚果皮中主要挥发性成分的相对含量具有较为显著的差异(P<0.05),这种差异性可能来源于不同树龄梁平柚树生理代谢能力的强弱。

进一步对检测出的各挥发性成分进行归类,结果(表2)表明烯烃类化合物含量、种类丰富,是构成梁平柚果香气成分的主要物质,占总挥发性成分的85%以上;醇类、醛类、酮类化合物在挥发性成分中也占有较大比重,其相对含量均>1%。采用Duncan’s新复极差法对组间差异进行分析,N5组的醛类、酮类、酯类及酸类等化合物相对含量显著高于N1和N2组(P<0.05),N1和N2组的醇类化合物相对含量显著高于N4和N5组(P<0.05),5个组的烯烃类无显著差异性(P>0.05)。

表2 各挥发性成分的种类和相对含量Table 2 Varieties and relative contents of volatile components

注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

在烯烃类化合物中,N5组不含莰烯、4-蒈烯、2-辛烯、双环[2.2.1]庚-2-烯、甘香烯、α-石竹烯等,N1组不含γ-萜品烯和p-伞花烃;(Z)-氧化芳樟醇、环戊-4-烯醇、薄荷-2,8-二烯-1-醇、(E)-2-已烯-1-醇、3-环己烯-1-醇、(E)-橙花叔醇、3,7,11-三甲基-6,10-十二烯-1-醇等醇类化合物未在N5组检出;(Z)-己酸-3-己烯酯、甲基棕榈酸、9,12-十八碳二烯酸、亚麻酸等酸、酯类化合物未在N1组检出。

结合表1和表2可以看出,在低树龄段(7～10年),梁平柚果皮精油的挥发性成分含有较多的小分子芳香物质,如α-蒎烯、莰烯、α-水芹烯、4-蒈烯、2-辛烯、1,3,5-环庚三烯、2-辛烯等。随着树龄的增长,精油中芳香物质不仅在富集,还在向更稳定的化合状态转变,由小分子萜烯类化合物经氧化成了留香较为持久、分子量较大的酮、酯等。另外,精油中挥发性物质的相对含量随着树龄的增长而有不同方向和程度的变化。如α-蒎烯、莰烯、桧烯、β-蒎烯、α-水芹烯、4-蒈烯、芳樟醇、薄荷-2,8-二烯-1-醇、L-香芹醇等芳香物质随着树龄增长,其相对含量逐渐减少;蛇床子素、亚麻酸、9,12-十八碳二烯酸(反式亚油酸)、顺式-9,12-十八碳二烯酸甲酯、正十六烷酸、甲基棕榈酸等大分子芳香物质随着树龄增长,其相对含量逐渐增加。这可能是因为幼树期,树势旺盛,养分供应偏向于营养生长,果实果皮厚、风味淡,随着树龄增大,树势趋于稳定,树体养分分配趋于平衡,枝叶的新陈代谢能力也较强,因而果实趋于均匀,果皮变薄,风味变浓[19]。由此可见,在品质、产地和制备方法相同的条件下,柚皮精油的组成及挥发性成分相对含量都存在差异性。

2.2 偏最小二乘法判别分析

为进一步研究不同树龄梁平柚皮精油挥发性成分的差异性,对其进行PLS-DA分析。PLS-DA分析法是一种集主成分分析、典型相关分析和多元回归分析为一体的统计方法,通过降维处理将重复的变量(关系紧密的变量)删去多余,建立尽可能少的新变量,使得这些新变量是两两不相关的,而且这些新变量在反映研究的信息方面尽可能保持原有的信息。

将试验中50个样品按不同树龄预先分组,通过SIMCA软件构建PLS-DA数学模型。由表3可知,PLS-DA模型包含5个主成分,前2个主成分累计方差贡献率为69.7%,综合了不同树龄柚皮精油挥发性成分的大部分信息,可以较好说明该数据的变化趋势。以不同树龄柚皮精油挥发性成分在第1、2主成分上的得分作图,主成分得分图(图2a)显示5种不同树龄梁平柚皮挥发性成分样品均处于相对独立的空间位置。在第1主成分平面上,可显著区分(N1与N5、N2与N4、N1与N4、N2与N5、N1与N3、N3与N5)样品,但对(N1与N2、N2与N3、N3与N4、N4与N5)样品区分效果不明显;在第2主成分平面上,可显著区分(N1与N2、N2与N3、N4与N5)样品,但对N3与N4组区分效果不明显。载荷图(图2b)中各挥发性成分的分布情况与主成分得分图中样本点的分布位置相对应。由此可见,PLS-DA可对不同树龄梁平柚皮精油挥发性成分进行一定的分类,说明其相对含量有着一定程度的区别。

表3 PLS-DA的特征值、贡献率及预测能力Table 3 Eigenvalues,cumulative contribution and predication performance by PLS-DA

图2 不同树龄柚皮精油的主成分得分图(a)和载荷图(b)Fig.2 PLS-DA score plots(a)and loading plots(b)of essential oil of pomelo peel with different ages注:图中a数字表示不同柚皮精油样品;图b表示不同挥发性成分。

图3 不同柚皮精油样品聚类树状图Fig.3 Cluster dendrogram of essential oil samples from different pomelo peels

2.3 凝聚层级聚类分析

分别以50个梁平柚皮精油和72种鉴定出的挥发性成分相对含量为原始变量,进行HCA分析,使品质相近聚在一起,采用word 聚类方法,使用欧式距离来计算不同类别数据点间的距离(相似度),构建50个梁平柚皮样品及72种挥发性成分聚类树状图。由图3可知,50个梁平柚皮样品在标度为230时可聚类为3类,第1类包含N4组(31～40号样)和N5组(41～50号样)的20个样品;第2类包含N3组(21～30号样)合N2组(38号样)的11个样品;第3类包含N1组(1～10号样)和N2组(21～27、29、30号样)的19个样品。由图4可知,72种柚皮挥发性成分在标度为0.49时可聚类为3类,第1类包含柠檬醛、d-柠檬烯、β-月桂烯、圆柚酮、α-法呢烯、蛇床子素等33种挥发性成分;第2类包含α-石竹烯、β-金合欢烯、大根香叶烯 B、乙酸香茅酯等11种挥发性成分;第3类包含α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、L-薄荷醇、芳樟醇等28种挥发性成分。结合PLS-DA得分图和载荷图,3类梁平柚皮样品分别位于得分图的左、中、右方位,而3类挥发性成分分别位于载荷图的左、中、右方位。对比图3及图4结果发现,HCA分析与PLS-DA分析结果存在一致性,可相互印证、互为补充。

图4 精油挥发性成分的聚类分析图Fig.4 Cluster dendrogram of volatile components in essential oil

2.4 不同树龄梁平柚皮特征挥发性物质分析

结合PLS-DA的载荷图和重要性变量因子(Variable important for the projection,VIP)值分析,可以找出区分不同树龄柚皮精油挥发性成分的潜在标志物。VIP值可以量化每个变量因子对分类的贡献[20],VIP值越大,挥发性成分对不同树龄柚皮精油样品的差异贡献越显著。通过计算出的VIP值(表4),发现有21个挥发性成分VIP值大于1。

表4 不同树龄柚皮挥发性成分中潜在标志物(VIP>1)Table 4 Potential markers of volatile components in pomelo peel with different tree ages(VIP>1)

将HCA分析结果结合PLS-DA主成分得分图和载荷图中的VIP值(表4)可知,将3类梁平柚皮精油样品区分开的特征挥发性成分为:乙酸香叶酯、正十六烷酸、L-紫苏醇、蛇床子素、β-石竹烯、δ-荜橙茄烯、β-榄香烯等7个成分为第Ⅰ类样品的特征物。正十六烷酸、蛇床子素的油脂味[8]和乙酸香叶酯、L-紫苏醇、β-榄香烯的草木味[17],使得这类柚皮精油具有强烈的草木油香味;(E)-2-已烯-1-醇、大根香叶烯 B、α-石竹烯、3-环己烯-1-醇、3,7,11-三甲基-6,10-十二烯-1-醇、β-金合欢烯等6个成分为第Ⅱ类样品的特征物。这类柚皮精油因β-金合欢烯、α-石竹烯具有典型柑橘香甜味[10-11];L-薄荷醇、(Z)-香芹酮、3,4-二甲基-2-己醇等余下的8个成分为第Ⅲ类样品的特征物,L-薄荷醇和(Z)-香芹酮使这类柚皮精油具有强烈的薄荷味。

图5 主成分载荷图Fig.5 Biplot of principal component analysis注:图中“■”表示不同精油样品,“●”表示VIP值>1的挥发性成分。

PLS-DA和HCA是两种重要的多变量统计分析方法,将较多的变量利用降维处理为尽可能少的新变量,使得这些新变量是两两不相关的,同时归纳出潜在标志物,目前其广泛用于食品、药品和农产品等品质差异性分析及亲缘鉴定识别。刘彬球等[20]利用PCA和PLS-DA分析法对不同等级的晒青毛茶多项理化成分进行统计分析,发现茶叶中的氨基酸组分含量是晒青毛茶级别分类的重要理化成分,其中赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)起着较为显著的作用;Lota 等[21]采用PCA和HCA分析法将15种宽皮柑橘归纳为3个化学类型:柠檬烯型、柠檬烯/γ-萜品烯型和乙酸芳樟酯/柠檬烯型;Pan 等[22]利用液相紫外检测串联质谱研究了不同产地玛咖的玛咖酰胺含量差异,并根据PLS-DA模型区分了产地。本试验运用HCA分析法将5个不同树龄段梁平柚皮精油聚类为3类,根据特征性挥发物质可将3类精油按香型分为草木油香味(N4和N5组),典型柑橘香甜味型(N3组),浓郁薄荷香型(N1和N2组)。

3 结论

梁平柚果皮富含丰富的芳香性挥发性成分,但不同树龄段果皮精油挥发性成分的组成具有一定差异性。在低树龄段精油中含有较多的小分子芳香物质;随着树龄的增长,酮、酯等留香较为持久、分子量较大的物质逐渐增多,使不同树龄段的柚皮精油呈现出不同的香型特征。因此,在梁平柚果皮精油的开发利用时,应根据其精油组分的变化趋势选择合适的加工工艺及产品类型,进行差异化开发利用。