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逐级盐析结合双水相法纯化贯筋藤凝乳酶

2020-02-18王庭伊黄艾祥

食品工业科技 2020年1期
关键词:硫酸铵饱和度活力

赵 琼,王庭伊,黄艾祥

(云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201)

贯筋藤(DregeasinensisHemsl.)为萝藦科,南山藤属植物,攀援木质藤本,俗称“奶浆藤”[1]。分布于云南大理、丽江、昆明等地,多生长于山地灌木丛中[2],目前尚未由人工引种栽培。贯筋藤也具有较大的药用价值,具有抗癫痫、祛风、除湿等作用[3];其叶的汁液可治多种皮肤癣;花是云南民间十二种食用花卉之一[4]。此外,陶亮等[5]调研发现,在云南大理剑川县、鹤庆县等地,人们将“奶浆藤”用温水浸泡后便作为一种凝乳剂来生产乳饼。因此,陶亮等[6-7]对贯筋藤及其凝乳成分展开了研究,并发现其主要凝乳成分为凝乳酶。姬昱等[8]对贯筋藤凝乳酶的急性毒性及遗传毒性作了研究,结果显示贯筋藤凝乳酶无毒性。Zhang Y等[9]鉴定贯筋藤凝乳酶分子量为24 kDa,属于半胱氨酸蛋白酶,且具有耐高温、稳定性高等特点,并探究了凝乳机制。这些研究为更好地开发及应用贯筋藤凝乳酶提供了一定的科学依据。

然而,目前贯筋藤凝乳酶的发展应用仍被提取制备方法单一、纯度低、活力弱等因素所制约。因此亟需寻找样品处理量大、回收率高、对酶活影响小、成本低的酶纯化方法。硫酸铵逐级盐析法常用于蛋白质分离及富集,在高浓度的硫酸铵溶液里,盐离子能够结合蛋白表面的水分子,从而破坏蛋白表面的水化膜,使蛋白质溶解度降低,因疏水作用聚集形成沉淀,因此可以将蛋白和其他杂质(如糖类等)分离开[10]。双水相萃取(aqueous two-phase system,ATPS)又称水溶液两相分配技术始于20世纪60年代,因其具有易操作、适于放大生产、不易破坏成分活性、环保等优点而被广泛应用。国内外关于双水相萃取分离蛋白的报道很多,不少研究者通过双水相萃取法从复杂组分中纯化出了高纯度的蛋白质及酶。如Amid M等[11]利用醇/盐两相纯化出芒果果皮中的丝氨酸蛋白酶。冯自立等[12]研究了无花果蛋白酶在PEG/(NH4)2SO4双水相体系中的分配行为。但关于利用双水相萃取法分离纯化贯筋藤凝乳酶的研究未见报道。

本研究首先利用硫酸铵盐析法对贯筋藤提取液进行粗分离,再利用双水相法粗酶进行纯化,并对纯化后酶的纯度进行电泳分析,旨在为贯筋藤凝乳酶的纯化提供一定的理论依据和技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

贯筋藤鲜茎 采自云南省剑川县;脱脂奶粉 澳大利亚德运公司;TRIS、SDS、Glycerol、Ammonium persulphate、Acrylamide、TEMED 分析纯,北京索莱宝有限公司;β-巯基乙醇 生化纯,上海麦克林生化科技有限公司;无水氯化钙、氯化钠、硫酸铵 分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司;牛血清蛋白 生化纯,上海源叶生物科技有限公司;考马斯亮蓝G-250、R-250 分析纯,上海源叶生物科技有限公司;聚乙二醇 分析纯,天津市光复精细化工研究所。

TLG20M台式高速冷冻离心机 长沙迈佳森仪器设备有限公司;HWS24电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;FD-1A-50冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司;BIO-RAD Mini电泳仪 美国伯乐;UV-6100S紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;MS-100金属浴 杭州奥盛仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 贯筋藤粗酶提取 采收贯筋藤鲜茎,阴凉处晾干后剪成5~10 cm小段,敲碎后按1∶10 (w/v)加入2.5% NaCl溶液(溶于pH6.0,0.05 mol/L磷酸缓冲溶液),4 ℃浸提12 h后用双层滤布过滤。

1.2.2 硫酸铵逐级盐析 采用硫酸铵逐级(0%~20%、20%~40%、40%~60%、60%~80%)沉淀出粗酶[13]。在搅拌条件下向1.2.1的提取液缓慢加入硫酸铵粉末,至溶解后饱和度为20%,于4 ℃条件下静置30 min,离心(10000 r/min,15 min,4 ℃),收集沉淀。继续向上清液加入硫酸铵粉末至溶解后饱和度为40%,静置,离心(10000 r/min,15 min,4 ℃),收集沉淀。重复上述操作,将不同饱和度沉淀出的酶转移至透析袋(3500 Da)中于去离子水中透析24 h,4 h换一次水。保持透析袋内外的静水压和渗透压不同,以跨膜转运除去硫酸铵。将透析后的截留液真空冷冻干燥(-50 ℃,0.2~1.0 mBar,72 h)成粉,-20 ℃保存备用。测其蛋白质含量及凝乳活力。

1.2.3 双水相法纯化贯筋藤凝乳酶

1.2.3.1 成相物质对凝乳酶活力的影响 不同种类及不同质量分数盐对贯筋藤凝乳酶的影响:分别取1 mL不同浓度(10%、12.5%、15%、17.5%、20%)柠檬酸钠、硫酸铵、硫酸镁溶液与1 mL粗酶液(3 mg/mL,溶于pH8.0,0.05 mol/L Tris-HCl Buffer中)充分混合,室温放置1 h。对照组为将1 mL盐替换为1 mL纯水。测其凝乳活力,并计算相对凝乳活力。

不同相对分子质量及质量分数PEG对凝乳酶活力的影响:分别取1 mL不同浓度(15%、17.5%、20%、22.5%、25%)PEG 1000、PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000溶液与1 mL粗酶液充分混合,室温放置1 h。对照组将1 mL PEG替换为1 mL纯水。测其凝乳活力,并计算相对凝乳活力。

1.2.3.2 绘制相图 参考Albertsson[14]浊点法,分别配制40% PEG 1000、2000、4000、6000溶液和43%硫酸铵溶液,准确称取0.700 g的PEG溶液于试管中,加入0.5 mL超纯水,然后缓慢向内滴加硫酸铵溶液,混匀,静置观察溶液的浑浊程度(刚好变得浑浊),记录加入硫酸铵的量,根据该量计算出硫酸铵的质量分数。然后重复以上操作,分别记录下达到浑浊时加入的硫酸铵的量,计算出在体系内加入硫酸铵的质量分数和PEG的质量分数,从而绘制相图。

1.2.3.3 PEG/硫酸铵比例的筛选 用40%PEG 1000、2000、4000、6000溶液和43%硫酸铵溶液,分别按PEG/硫酸铵(%,w/w)=20.57/14.74、22.86/12.29、24.57/10.44比例制备双水相体系,体系总体积为6 mL,再分别向体系中加入1 mL粗酶液,在涡旋混合器上充分混合1 min后室温静置1 h[11]。用胶头滴管分离上下相,分别读取上、下相的体积,测定上、下相的蛋白含量测定和凝乳活力并计算其比活力。

1.2.3.4 酶用量对纯化效果的影响 在最佳的PEG/盐体系中加入不同体积的酶液(0.5、1.0、1.5、2.0 mL),充分混匀,室温静置1 h,分离上下相,测定蛋白质含量及凝乳活力。

1.2.4 指标测定及计算

1.2.4.1 凝乳活力测定 参照文献[15]方法:配制10%脱脂奶(脱脂奶粉溶于0.01 mol/L CaCl2溶液),取1 mL脱脂奶于85 ℃水浴预热5 min后加入0.1 mL酶液,准确记录凝乳时间。凝乳有效时间为40 min内。计算公式如下:

凝乳活力(MCA)=(2400×V)/(t×v)

式中,V(mL):乳体积;v(mL):酶液体积;t(s):凝乳时间。

1.2.4.2 考马斯亮蓝法测定蛋白含量 参照邓丽莉等[16]方法,绘制牛血清蛋白标准曲线,标准方程为:y=0.0078x+0.0751(R2=0.9952),线性范围为0~100 μg/mL。

1.2.4.3 相关纯化指标计算 a.酶比活力:酶比活力定义为在特定条件下,单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数。计算公式如下:

比活力=凝乳活力/蛋白含量(MAC/mg)

b.相对凝乳活力:在特定条件下,以母液酶的凝乳活力为100%,计算其他处理酶液的相对凝乳活力。计算公式[17]如下:

相对凝乳活力(%)=贯筋藤凝乳酶处理液凝乳活力/母液凝乳活力×100

c.选择性S:在特定条件下,贯筋藤凝乳酶的分配系数(Ke)与蛋白质含量(Kp)之比。计算公式[11]如下:

选择性S=Ke/Kp=(AT/AB)×(PB/PT)

式中,AT为上相酶的凝乳活力(MCA);AB为下相酶的凝乳活力(MCA);PB为下相总蛋白质含量(mg);PT为上相总蛋白质含量(mg)。

d.纯化倍数(PFT):在特定条件下,纯化后酶的比活力除以粗酶的比活力。计算公式[11]如下:

PFT=上相酶的比活力/粗酶的比活力

e.回收率YT(%):为在特定条件下,蛋白在纯化过程中的回收率。计算公式[11]如下:

YT(%)=100/(1+(1/VR×Ke))

式中,VR上下相体积之比;Ke为贯筋藤凝乳酶的分配系数。

1.2.5 SDS-PAGE电泳检测分离纯化贯筋藤凝乳酶的纯度 对贯筋藤凝乳酶进行SDS-PAGE电泳实验,分析双水相对贯筋藤凝乳酶纯化情况。参照Laemmli等[18]方法稍作修改,制胶(15%分离胶、4%浓缩胶)→样品处理(样品∶上样缓冲液=1∶1,混匀,金属浴95 ℃处理10 min,10000 r/min离心2 min)→上样(每孔上样量10~20 μL)→电泳(浓缩胶50 V,30 min;分离胶120 V,约90 min)→固定(30%甲醇,30 min)→过夜考染→脱色(脱色至条带清晰)→拍照→Image Lab软件分析胶片。

1.3 数据处理

本文实验每组重复三次,取平均值为最终数据。利用Excel 2010、OriginPro 9.0及Image Lab软件处理数据及绘图。

2 结果与分析

2.1 硫酸铵逐级盐析结果

由图1可知,逐级盐析过程中,当硫酸铵饱和度区间为20%~40%时,贯筋藤凝乳酶的比活力最高(167.846 MCA/mg)。随着硫酸铵的饱和度继续升高,酶的活力逐渐降低,原因可能是贯筋藤凝乳酶情况较复杂,其在硫酸铵沉淀中是一个逐渐沉淀的过程,硫酸铵饱和度从0%~80%均能析出有活力的酶,但饱和度为20%~40%沉淀出的酶活力最高,此时到达一个生物分子之间排斥力很小的阶段,酶很容易相互聚集,在溶液中的溶解度降低,从而沉淀析出,且此时析出的凝乳酶表现出较大比活力[19]。考虑到尽量在损失少量酶的同时除去其他杂蛋白,以获得较高纯度和活力的贯筋藤凝乳酶,因此选择20%~40%为最佳硫酸铵盐析饱和度区间。张学俊等[20]利用硫酸铵沉淀法分离PabB酶,SDS-PAGE图发现该酶在硫酸铵饱和度20%~75%的沉淀中均有出现,并认为该酶在硫酸铵沉淀中是逐渐沉淀的过程,与本文结果结果相似。

图1 硫酸铵逐级盐析结果图Fig.1 Result of ammonium sulfate stepwise salting-out diagram

2.2 双水相纯化结果

2.2.1 相成分对贯筋藤凝乳酶活力的影响

2.2.1.1 不同种类及不同质量分数盐对贯筋藤凝乳酶的影响 硫酸镁、柠檬酸钠和硫酸铵等盐常作为双水相萃取体系中的成相成分被用于蛋白和酶的分离,且具有较好的分离效果。Senphan T等[21]利用叔丁醇/硫酸镁双水相体系从太平洋白虾的肝胰腺中分离高纯度的蛋白酶。Da Silva O S等[22]利用PEG/柠檬酸钠从固态发酵产生的曲霉(Aspergillustamarii)URM4634中纯化出纯度较高的蛋白酶。Gagaoua M等[23]利用叔丁醇/硫酸铵体系首次从Cucumismelovar.reticulatus中纯化出活性较稳定的凝乳酶。参考上述文献,选用硫酸镁、柠檬酸钠和硫酸铵作为本研究的盐体系,再从中筛选出最佳的盐组分。

图2为3种盐对贯筋藤凝乳酶活力的影响,3种不同的盐对酶活力的影响较大,硫酸镁>柠檬酸钠>硫酸铵。不同浓度硫酸镁溶液处理后的酶,在有效凝乳时间(40 min)内均未凝乳。不同浓度柠檬酸钠处理后的酶相比原酶活力降低了约70%。李双安等[24]研究表明,柠檬酸钠、硫酸镁能与血液中的Ca2+子结合成螯合物,而使钙离子失去凝血作用,从而阻止血液凝固,常用作抗凝剂。结合凝乳酶的凝乳机理发现,酶将酪蛋白表面的κ-酪蛋白剪切开,使得副κ-酪蛋白和β-酪蛋白在Ca2+作用下凝结沉淀,而柠檬酸钠、硫酸镁可能与Ca2+结合使乳中的游离Ca2+减少,从而导致凝乳缓慢且效果不佳。从硫酸镁和硫酸铵两种盐浓度对酶的影响可看出,随着两种盐的浓度增大,酶的活力逐渐减小,可能是因为盐浓度过高,易导致蛋白析出或变性。综上所述,在双水相萃取体系中,选用硫酸铵作为最佳盐相,且质量分数应小于15.0%。

图2 盐对酶活力的影响Fig.2 Effect of salt on enzyme activity

2.2.1.2 不同相对分子质量及质量分数的PEG对贯筋藤凝乳酶的影响 将贯筋藤凝乳酶与不同相对分子质量、不同质量分数的PEG等比混合,考察其对酶活性的影响,结果如图3。从图3可看出,不同相对分子质量的PEG对贯筋藤凝乳酶的活性均有一定的影响,但透析(7000 Da)酶液后该影响可被消除。原因可能为酶液中PEG不利于凝乳酶与脱脂奶粉接触或影响游离Ca2+与副κ-酪蛋白和β-酪蛋白接触,导致酶的凝乳活力略微受到影响。

表1 双水相相成分及配比筛选Table 1 Selection of composition and ratio of aqueous two phase

从PEG浓度来看,随着PEG 2000浓度的升高,酶活力也逐渐升高,浓度达22.5%时趋于平缓,其他相对分子质量PEG随浓度增加酶活力无明显变化。Ooi C W等[25]也是利用PEG/盐体系分离脂肪酶,PEG对酶的活力有一定抑制作用,但由于抑制作用不明显且可消除,故被用于后续分离纯化中。因此,在本研究中不同浓度不同相对分子质量PEG均可用作相成分对贯筋藤凝乳酶进一步纯化。

图3 PEG对酶活力的影响Fig.3 Effect of PEG on the activity of the enzyme

2.2.2 相图 相图是双水相萃取法中制备稳定相体系的重要参考条件,也是两相体系分相的重要基础。结合成相物质对酶活力的影响,选择硫酸铵为盐相、不同相对分子质量PEG为有机相制作相图。图4为40%PEG(1000、2000、4000、6000)与43%硫酸铵的相图。相图中双节线上各点为临界点,双节线以上的区域为分相区(上相主要为PEG,下相主要为硫酸铵),双节线以下的区域为混合区。从图4可看出,当PEG质量分数一定时,相对分子质量越小,所需的硫酸铵质量分数越大,PEG相对分子量越大,分相临界点越小,成相物质浓度较少即可成相,与田盼盼等[26]研究结果相似。因此选用双节线以上的两相质量分数作为制备稳定的纯化贯筋藤凝乳酶相体系的重要参考条件。

图4 不同相对分子量PEG/硫酸铵体系相图Fig.4 Phase diagram of different molecular weight PEG/ammonium sulfate system

2.2.3 PEG/硫酸铵配比的筛选 为了优化贯筋藤凝乳酶在PEG/硫酸铵体系中的分配效率,结合相图(图4)中双节点以上的两相浓度和成相物质对酶活力的影响,选出了三组浓度配比共12个稳定体系对酶分配效果进行了评价。表1为贯筋藤凝乳酶在不同相对分子质量和浓度的PEG/硫酸铵体系中的分配情况,两相的浓度从10.44%~24.57%不等,测定了该酶在体系中的选择性、纯化倍数和回收率。实验结果用三次重复实验结果的平均值表示。

由表1中可知,在PEG相对分子量为6000,PEG/硫酸铵为20.57/14.74体系中,贯筋藤凝乳酶的分配效率最佳,选择性为47.842,纯化倍数为1.870,回收率为98.096%。高分子量的PEG对酶的纯化效果较好,而增加PEG的浓度反而会降低酶的纯化效果。从分配理论来解释,随着PEG的浓度增加,相界面张力也随之增大,不利于酶向上相(PEG相)富集,而当减小PEG的浓度,硫酸铵的盐析作用起主导作用,使得酶向上相富集[27]。Vaidya等[28]研究表明,相对分子质量小的PEG不适合蛋白质的分离。故本实验选用PEG 6000,PEG/硫酸铵为20.57/14.74(%,w/w)作为贯筋藤凝乳酶纯化的双水相体系条件。

2.2.4 酶用量对纯化的影响 由表2可知,随着酶用量增大,纯化倍数PFT也随之增大,当用量大于1 mL时,各项指标均逐渐减小。实验中发现,随着用量增大,体系稳定性越差,当酶用量达2 mL时,相平衡几乎被打破,无法达到分离效果。综合酶处理量、纯化效率等因素,故选用1 mL为最佳酶用量。

表2 酶用量对纯化的影响Table 2 Effect of enzyme dosage on purification

2.3 双水相纯化效果

2.3.1 双水相纯化效果图 由图5可看出,双水相萃取体系形成明显的上下层:上层是以PEG 6000为主的有机相;下层是以硫酸铵为主的盐相。实验结果表明,上层颜色较深,具有较高的酶活力,主要富集了目标凝乳酶;下层颜色较浅,没有酶活力,可能为一些带颜色的杂质。

图5 双水相纯化贯筋藤凝乳酶效果图Fig.5 Effect diagram of two-phase purification of enzyme from Dregea sinensis Hemsl.

2.3.2 凝乳效果图 图6为经双水相纯化并透析的贯筋藤凝乳酶凝乳图,从图6中可看出对照组(0.05 mol/L,pH8.0 Tris-HCl)未凝乳;盐析组(硫酸铵饱和度20%~40%)虽然凝乳,但乳块有轻微的褐色,且乳清浑浊;双水相纯化组凝乳较好,乳块呈乳白色,乳清呈淡黄色。说明经双水相纯化后的贯筋藤凝乳酶颜色和活力都有了一定的改善和提高。

图6 贯筋藤凝乳酶凝乳图Fig.6 Milk-clotting diagram of Dregea sinensis Hemsl. enzyme

2.4 SDS-PAGE电泳

从图7可看出,对比2号(未除NaCl,影响电泳时电荷迁移所以条带歪扭)、3号泳道可明显看出,4号泳道酶条带清晰、纯度较高,分子量约为25 kDa。说明经过双水相萃取纯化后贯筋藤凝乳酶杂质含量少,纯度较高。

图7 贯筋藤凝乳酶电泳图Fig.7 SDS-PAGE electropherogram of Dregea sinensis Hemsl. milk-clotting enzyme注:1号泳道为蛋白Marker(从下到上为10~180 kDa), 2号泳道为贯筋藤盐提液,3号泳硫酸铵饱和度为20%~40% 盐析粗酶,4号泳道为双水相纯化的贯筋藤凝乳酶。

3 结论

硫酸铵逐级沉淀贯筋藤粗酶时,当硫酸铵饱和度区间为20%~40%时,贯筋藤凝乳酶的比活力较高,说明通过硫酸铵逐级盐析,可有效除去提取液中的杂质成分,提高酶的纯度。再利用双水相萃取法对粗酶进一步纯化,当盐组分为硫酸铵、PEG相对分子质量为6000、PEG/硫酸铵质量为20.57%/14.74%、酶用量为1 mL时,贯筋藤凝乳酶的纯化倍数达1.87,回收率达98.096%。对贯筋藤凝乳酶进行SDS-PAGE分析可知经双水相纯化的贯筋藤凝乳酶条带清晰、杂质少、纯度较高,分子量约为25 kDa。利用双水相分离纯化可获得高纯度的贯筋藤凝乳酶,且该法易操作、环保、成本低,可为贯筋藤凝乳酶后续规模化生产及应用奠定基础、提供指导意义。

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