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(1.南宁师范大学广西地标作物大数据工程技术研究中心,广西南宁 530001;2.南宁师范大学北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室,广西南宁 530001;3.容县土肥植保经作站,广西容县 537500)

沙田柚(Citrusgrandisvar.shatinyu)属芸香科柑橘属,原产地为广西壮族自治区容县沙田村,是我国栽培面积最大、产量最高的柚类品种[1]。沙田柚果形硕大,风味独特清香,一般来说沙田柚果实在常温可以储藏4～6个月[2],是柑橘类中耐存储的品种,有“天然水果罐头的美誉”[3],沙田柚果实采收后即变为一个独立的代谢系统,沙田柚品质主要由采收时的品质所决定[4]。

根据前期调研发现,沙田柚果实品质是沙田柚生产中的限制因素,果实过大或过小的沙田柚品质都不佳。前人研究也发现,较大的沙田柚果实品质并非最佳[5],沙田柚果实大小和品质关系目前没有相关报道。本文以此为切入点对沙田柚果实大小和品质的关系及其可能机理进行研究,以期对沙田柚果树采摘前疏花疏果管理、采后果实分级,进而对沙田柚经济效益的提升有所帮助。

本研究以沙田柚为材料,对采后沙田柚品质相关的性状(可溶性固形物、沙田柚果皮厚度、种子数目、果形指数)和沙田柚大小的关系进行研究,同时对同株果树上、不同大小的沙田柚进行转录组测序,以期对果实重量影响品质的分子机制进行初探。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙田柚 试验基地依托玉林市容县容州镇五一柚场(经度111.33°,纬度22.55°,最高海拔151米),柚场拥有2000株20～30年生成熟沙田柚果树,2018年11月,按照柚场方位东、南、西和北坡位,随机等量采收套袋的沙田柚,采后运回室内选择成熟度较一致、果皮无损伤和无病虫伤疤的沙田柚果实,试验可用果实303个。

工业级电子数显游标卡尺 钢拓公司;数显糖度计 FANUOWEI公司;JA2603B电子天平 上海精科天美;HISeq4000测序平台 美国Illumina;Mastercycler X50h PCR仪器 德国Eppendorf。

1.2 实验方法

1.2.1 品质指标测定

1.2.1.1 果实总重量(全果,带果皮)的测定 利用电子天平直接测量;沙田柚大小分组参考中华人民共和国农业行业标准,果实质量等级划分为900～1099、1100～1299、≥1300 g 三个等级[6],本研究将其细化,以50 g差异为分组标准。

1.2.1.2 可溶性固形物含量测定 取果实赤道附近果肉囊瓣中部的汁胞,每次取样30 g,置于纱布榨取汁液,而后利用FANUOWEI数显糖度折射仪器测定可溶性固形物(soluble solid content,SSC)含量,每个果实三次重复[7]。

1.2.1.3 果皮厚度及果形指数的测定 利用四分法对称切割沙田柚,利用游标卡尺统一测量四份沙田柚纵径赤道处果皮厚度,取其均值为果皮厚度。利用游标卡尺直接测量果实的横纵径[8],果形指数=纵径/横径。

1.2.2 转录组测序 为对其采后品质差异机理进行研究,在同一株沙田柚果树上选850～900、1150～1200 g沙田柚进行转录组测序,选三株树作为三次重复处理。

测序材料前处理:采后沙田柚四分法对称切割,每份均匀取果肉,装入50 mL无菌离心管,液氮速冻。

转录组测序:转录组测序委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成;取RNA 1.5 μg,富集纯化后,利用六碱基随机引物合成cDNA第一链,随后利用DNA聚合酶和RNase H合成cDNA第二链,再用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA经过修复、A尾接头后,进行片段大小选择。而后扩增、纯化,得到最终的文库。文库构建完成后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq测序。

差异表达基因筛选及富集分析:基因差异表达的输入数据为基因表达水平分析中得到的readcount数据。本研究的两个组别有三次生物学重复,采用DESeq2[9]进行分析,筛选阈值为padj<0.05且|log2FoldChange|>1。Pathway显著性富集分析以KEGG Pathway为单位,应用超几何检验,找出差异基因相对于所有有注释的基因显著富集的pathway[10]。

1.3 数据处理

生理指标利用Excel进行数据录入,利用SPSS 23进行数据处理;利用KAAS软件进行KEGG注释,利用Blast2go软件进行GO注释,利用DEGSeq2软件进行差异表达分析。

2 结果与分析

2.1 沙田柚大小与品质相关指标的关系

2.1.1 随机采摘沙田柚的质量分布 本研究中,303个沙田柚果实质量在817.79～1390.17 g之间,按照重量将沙田柚划分为10组,其中低于900 g和高于1300 g的沙田柚由于数量相对较少,分为两组,质量在900 g～1300 g之间的沙田柚以50 g差异为区分,划分为八组。本研究中,沙田柚的平均质量为1094.95 g,对其进行正态分布检验发现,K-S结果sig=0.2>0.05,说明本研究中沙田柚质量分布符合正态分布,质量主要集中在1000～1150 g这3个组别之间,合计162个沙田柚(图1)。

图1 不同大小沙田柚数量分布图Fig.1 Distribution of different sizes of Shatian pomelo

2.1.2 果实大小和可溶性固形物之间的关系 在水果中,可溶性固形物决定了果实的风味和品质[11]。调研发现,在生产实践中可溶性固形物含量是沙田柚品质评判最直接的指标。本研究中,全部沙田柚可溶性固形物含量值在9.53%～14.83%之间。由图2可知,各个组别之间可溶性固形物含量均值在11.23%～11.94%之间,950～1000 g组别可溶性固形物含量最高,900～950 g的组别最低,可溶性固形物的平均值为11.55%,对其进行多重比较发现,沙田柚果实并非越大可溶性固形物含量越高,适中大小的沙田柚具有最高的可溶性固形物含量。

图2 沙田柚大小与可溶性固形物关系Fig.2 The relationship between the size of Shatian pomelo and soluble solids content注:数据代表平均值±标准差;不同字母表示 差异显著(P<0.05);图3～图5同。

2.1.3 果实大小和沙田柚种子数之间的关系 对植物本身来说,无核或少核是一个不利的性状,但对果实品质来说,无核或少核是一个优良的性状,该性状对沙田柚的鲜食或作为原料进行加工有重要意义[12]。沙田柚大小与种子个数关系如图3所示。本研究中,沙田柚发育完全的种子数目为4～236,平均值为100.27,不同组别之间沙田柚种子数目平均值为58.88～119.45,且随着重量的增大果实种子数增加,这说明沙田柚果实的生长发育和种子数目存在密切的关系。

图3 沙田柚大小与种子数关系Fig.3 The relationship between the size of Shatian pomelo and seed number

2.1.4 果实大小和沙田柚果皮厚度之间的关系 沙田柚皮厚增加时,可食率降低[13]。沙田柚大小与沙田柚皮厚度关系如图4所示。本研究中,沙田柚果皮厚度值在13.97～24.42 mm之间,不同大小的沙田柚果皮厚度平均值在17.52～20.37 mm,平均果皮厚度为18.12 mm,950～1000 g这一组果皮最薄。随着沙田柚质量的增加,沙田柚果皮厚度增厚。在沙田柚重量1200 g以下时,果皮厚度无显著变化(P>0.05),沙田柚重量超过1200 g的3组与其他各组之间果皮厚度存在显著差异(P<0.05)。

图4 沙田柚大小与沙田柚皮厚度关系Fig.4 The relationship between the size of Shatian pomelo and thickness of the peel

2.1.5 果实大小和沙田柚果形指数之间的关系 果形指数可以体现沙田柚的外观品质,外观品质是果实价值的一部分。沙田柚大小与纵横径比值的关系如图5所示。本研究中,沙田柚果形指数在0.94～1.45,果形指数平均值为1.19,不同大小的沙田柚果形指数平均值为1.16～1.23,果形指数随着沙田柚重量增加波动上升,但各组别之间果形指数无显著性差异(P>0.05)。

图5 沙田柚大小果形指数的关系Fig.5 Relationship between the size of Shatian pomelo and fruit-shape index

2.1.6 沙田柚重要指标之间的相关性分析 利用SPSS软件对沙田柚几个重要指标进行相关性分析,结果如表1所示。由表1可知,沙田柚果实质量和种子数、纵径、横径、皮厚度四个指标极显著正相关(P<0.01),这一结果与前文所述结果存在一定的对应性;种子数和可溶性固形物含量极显著正相关(P<0.01),和皮厚度呈显著负相关(P<0.05),这一现象可能与种子分泌沙田柚内源激素对果实的调节有关;可溶性固形物含量除和种子数极显著正相关(P<0.01)外,和果形指数同样呈极显著正相关(P<0.01),这为地理标志农产品对容县沙田柚外观要求为葫芦形或梨形的合理性提供直接的证据。

表1 沙田柚重要指标相关性分析Table 1 Correlation analysis of important indexes of Shatian pomelo

注:“*”表示差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01)。

由于全部沙田柚可溶性固形物含量和质量没有相关性,对其进行分段探讨发现,1000 g以下,沙田柚可溶性固形物含量和沙田柚质量极显著正相关,相关系数达0.4566(P<0.01),950～1150 g之间极显著负相关,相关系数为-0.2251(P<0.01)。950～1200 g,质量和可溶性固形物含量之间关系为显著负相关,相关系数为-0.1464(P<0.05)。超过1200 g的组别,质量和可溶性固形物含量之间相关系数没有达到显著水平(P>0.05)。

2.2 不同大小的沙田柚转录水平的差异

综合考虑果实重量和可溶性固形物两个指标,由于可溶性固形物含量在质量超过1200 g和低于950 g的5个组别之间没有差异,而可溶性固形物值最高的两个组别与最低的组别质量相邻,所以选择850～900 g和1150～1200 g作为小和大两组沙田柚进行转录组测序,分析不同质量沙田柚品质差异的可能原因。

2.2.1 测序结果、质量评估、功能注释及其分类 本研究中,碱基百分比(Q20)含量在97.73%～98.00%,Q30含量在90%以上,即本研究得到的测序质量较好。组装获得Unigene后对基因功能进行注释,合计注释 Unigenes数目为31728,所有的Unigenes都被注释成功。根据Nr库比对上的物种分布图如图6,其中85.1%的Unigenes被柑橘属植物比对成功,分别是橙子、克莱门柚和温州蜜柑,另外有0.9%被蓖麻和0.7%被拟南芥比对成功。

图6 Nr库比对上的物种分布图Fig.6 Species distribution map by nr library comparison

对基因做KO注释后,可根据它们参与的KEGG代谢通路进行分类,合计涉及到5个大类、19个小类,其中涉及到翻译相关基因的最多,有717个,膜转运相关的基因最少,有30个,具体结果如图7所示。

图7 KEGG代谢通路Fig.7 KEGG metabolic pathway注1:A:细胞进程(Cellular processes);B:环境信息处理(Environmental information processing);C:遗传信息处理(Genetic information processing);D:新陈代谢(Metabolism);E:生物系统(Organismal systems)。

2.2.2 差异表达基因KEGG富集结果 通过对各测序样本的检验,不同大小的沙田柚之间筛选出差异表达基因969个,其中597个上调基因,372个基因表达下调。通过Pathway显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。差异表达基因涉及82个代谢通路,包括内质网蛋白加工、淀粉与蔗糖代谢、植物激素信号转导、戊糖和葡糖醛酸盐相互转化和半乳糖代谢等。大小不同的沙田柚显著富集的前20个代谢通路中,有10个与食味品质直接相关,2个与外观品质直接相关(表1)。

在富集到植物激素信号转导的差异基因中,涉及7种植物激素和10个基因,这7种植物激素中,生长素(Aux/IAA、SAUR)、细胞分裂素(CRE1、A-ARR)、脱落酸(PYR/PYL)、油菜素内酯(CYCD3)、茉莉酸(JAZ)相关的基因表达下调,乙烯(EIN3、MPK6)和水杨酸(TGA)相关基因表达上调,激素和物质代谢的相互作用可能是产生大小不同沙田柚品质差异的原因。

表2 差异表达基因的代谢通路注释Table 2 KEGG metabolic pathways annotation of differentially expressed genes

3 讨论

3.1 沙田柚果实大小和品质之间的关系

在沙田柚中,可溶性固形物是果实风味和品质的决定性物质,同时也是重要的能源物质,也可以作为中间产物参与到采后果实的物质代谢中,调控果实的采后生理。研究表明,合适大小的脐橙果实品尝风味更好、可溶性固形物含量更高[14],小果的砂糖橘果实风味和可溶性固形物含量高于大果[15],经过存储后的椪柑大果风味更优[16]。这些研究表明,大小对柑橘类水果可溶性固形物的影响受到遗传因素的限制,不同的水果之间具有不同的特性。本研究中,大小适中的沙田柚可溶性固形物含量最高,与在脐橙中的研究结果类似,这一特性可能与在遗传上沙田柚测序结果与脐橙有最高的相似度有关(32.6%)。

虽然柚子皮有一定的食用和加工价值[17],但柚子皮厚度增加可食率降低,果皮厚度这一性状不利于沙田柚鲜食。本研究中,1200 g以下组别果皮厚度之间无显著性差异(P>0.05),超过1200 g的组别随着果实大小的增大,皮厚不断增加。对于鲜食类果品,种子多仍然是一个不利性状,陈建业等研究表明,少核沙田柚与多核沙田柚相比,单果质量显著性降低,可溶性固形物含量和果皮厚度极显著降低,其原因可能是激素调节导致[18]。这一结果与本研究的结果类似,本研究侧重点为果实大小,大小不同的果实来源于同遗传背景的沙田柚,得出果重低的沙田柚核少、可溶性固形物含量低和果皮厚度低,结合采摘时转录组测序的结果,本研究产生的结果也可能是种子可以分泌植物激素所导致。

3.2 大小不同的果实品质差异可能的分子机理

果实发育是一个动态连续的过程,这一过程中任何一个阶段的变化都可能对果实品质产生影响[19],由于全过程的复杂性,本研究选取果形已经确定、果实发育完全的这一个阶段进行转录组测序,试图探寻果实大小与品质产生差异可能的分子机理。

植物激素参与植物生长发育的各个阶段,影响着果实品质[20]。不论呼吸跃变型果实还是非呼吸跃变型果实,乙烯和脱落酸(ABA)都有促进果实成熟的作用,乙烯在这一过程中起到核心的作用[21-23],在沙田柚中的研究表明,外源乙烯对沙田柚采后品质影响不大,但对沙田柚果实退绿有较大影响[6]。水杨酸有着促进果实膨大、抑制果实成熟的所用,其作用机理可能是抑制乙烯合成完成,油菜素内酯同样通过抑制乙烯的合成延缓果实的成熟,生长素(IAA)、细胞分裂素在一定程度可以延缓果实的成熟衰老过程[24-27]。本研究发现,富集最显著的20条pathway中,14条涉及到风味品质相关的物质代谢,2条涉及植物激素相关,分别是植物激素的信号转导和油菜素内酯的生物合成,在小沙田柚和大沙田柚之间比较,涉及到生长素信号转导途径中的Aux/IAA基因和SAUR基因表达下调,涉及细胞分裂素信号转导途径中的CRE1基因表达下调,涉及油菜素内酯信号转导的CYCD3基因表达下调,茉莉酸信号转导途径的关键组分JAZ基因表达下调,同时涉及乙烯信号转导途径中重要的核转录因子EIN3表达上调,根据前人的研究结果,以上基因的变化可能促进沙田柚果实的成熟,内源乙烯的变化可能是大、小沙田柚品质产生差异的重要原因。此外,ABA代谢受体PYR/PYL基因表达下调,水杨酸代谢途径中的TGA基因表达上调,说明了激素调控果实品质的复杂性,其具体机理还需要进一步研究。

4 结论

大小适中的沙田柚,即质量在950～1000 g的沙田柚可溶性固形物含量高,1000 g以下沙田柚可溶性固形物含量值和沙田柚质量极显著正相关(P<0.01),950～1150 g之间极显著负相关(P<0.01),950～1200 g之间质量和可溶性固形物含量之间呈显著负相关(P<0.05)。超过1200 g的组别,质量和可溶性固形物含量之间相关系数没有达到显著水平(P>0.05)。沙田柚果实质量和种子数、纵径、横径、皮厚度四个指标极显著正相关(P<0.01),种子数和可溶性固形物含量呈极显著正相关(P<0.01),和皮厚呈显著负相关(P<0.05)。可溶性固形物含量值除和种子数极显著正相关(P<0.01)外,和果形指数同样呈极显著正相关(P<0.01)。对不同大小沙田柚进行转录组测序分析,筛选出差异表达基因969个,其中597个上调基因,372个基因表达下调,差异表达基因涉及82个代谢通路,激素和物质代谢的相互作用可能是产生大小不同沙田柚品质差异的原因。本结果可为沙田柚采前疏花疏果和采后激素调节提供参考。