(兰州市食品药品检验所,甘肃兰州 730050)

枸杞(LyciumbarbarumL.)是一种重要的药食同源农产品,深受广大消费者的喜爱[1]。枸杞因多适宜在盐碱地和退耕还林地种植,使其成为西北地区主要经济作物[2],主要分布在宁夏、甘肃、新疆、青海等地。由于其含糖量高,病虫害情况严重,目前主要是以化学药物防治[3],但生产者为了确保产量,常常对其不规范使用化学药物,造成了农药残留超标,这不仅对生态环境造成污染,更可能对消费者的身体健康产生直接或者潜在的危害。因此,建立枸杞中农药残留的检测方法对于保障枸杞市场的质量和人们的健康具有重要的意义。

目前,枸杞中农药残留仪器检测技术有很多,主要是气相色谱法[4]、气相色谱-串联质谱法[5-6]、液相色谱法[7]、液相色谱-串联质谱法[3,8-10]等。其中高效液相色谱-串联质谱法是一种具有灵敏度高、分析速度快、高通量等特性的定性定量分析方法,在多种农药残留分析中被广泛应用。目前,利用高效液相色谱-串联质谱法测定农药残留的监测模式多数是采用多反应监测模式,对动态多反应监测模式的检测还鲜有报道。罗辉泰[11]在测定饲料中药物残留采用了动态多反应监测方式,在保证准确定量的情况下仍具有较高的检测灵敏度,但是关于枸杞中农药残留采用动态多反应监测方式进行测定的至今尚未见报道。动态多反应监测模式的优势是根据色谱分析时间对每个组分的保留时间窗口进行动态分配,仅当组分流出时才被采集,这种科学的分段方式有效减少了同时扫描不同的离子对的数目,并一定程度上提高了驻留时间,大大提高了整个实验的分析效率。本实验的研究对象枸杞干果含水量低,且含有多糖、有机酸、类胡萝卜素、脂肪等物质[12],在测定时需要充分提取和净化,因此本实验考虑从复水量、提取溶剂、净化填料和配比等条件优化来提高提取净化效果,通过高效液相色谱-串联质谱法的动态多反应监测模式测定建立简单快速、准确可靠的同时测定44种农药多残留分析方法,为枸杞中多种农药残留快速检测提供科学的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞 兰州市售;甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、霜霉威、多菌灵、噻菌灵、灭多威、噻虫嗪、吡虫啉、乐果、啶虫脒、硫环磷、抑霉唑、甲基硫菌灵、甲萘威、嘧霉胺、异丙威、烯酰吗啉、乙霉威、丙森锌、嘧菌酯、啶酰菌胺、氟硅唑、戊菌唑、联苯肼酯、除虫脲、虫酰肼、氯唑磷、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、苯霜灵、氰霜唑、苯酰菌胺、四螨嗪、辛硫磷、氟苯脲、噻嗪酮、炔螨特、哒螨灵、涕灭威 均为德国Dr. Ehrenstorfer. Gmbh公司;杀线磷、久效磷、甲基硫环磷 均为北京曼哈格;氯吡脲、噻螨酮 均为北京郑翔科技有限公司;以上对照品纯度均≥98.0%。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸 均为色谱纯,德国Merck公司;乙酸铵 HPLC级,美国Sigma公司;丙酮 色谱纯,科密欧化学试剂有限公司;QuEChERS净化管填料:乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶(PSA)40～60 μm、石墨化炭黑(GCB)40～120 μm、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)40～60 μm 均为 美国Agilent 公司;无水硫酸镁、无水醋酸钠、氯化纳、柠檬酸二钠、柠檬酸钠 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1260HPLC-6460三重四极杆液质联用仪 美国Agilent公司;5810R高速低温离心机 德国Eppendorf公司;A11基本型分析研磨机,KS501圆周振荡摇床 德国IKA公司;MS205DU电子天平、BSA224S-CW电子天平 德国Sartorius公司;EVA32多功能样品浓缩仪 北京普立泰科公司;VORTEX-5涡旋混匀器 海门其林贝尔公司;Milli-Q超纯水机 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 准确称取各供试标准品,据标准物质溶解性用乙腈、甲醇分别制成1.00 mg/mL的标准储备液,4 ℃冷藏避光保存,备用;临用前配制成0.002～0.200 mg/L的44种混合标准工作溶液。

1.2.2 样品制备 取枸杞干果样品,-20 ℃冷冻48 h后立即用分析研磨机粉碎,精密称取样品5 g(精确至0.001 g),置50 mL离心管中,加入10 mL超纯水振荡混匀(复水处理),再加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈,涡旋1 min,在摇床上振荡20 min,放入冰箱中-18 ℃冷冻20 min,加入4 g硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠,立即涡旋混合均匀1 min,以4 ℃、3900 r/min离心10 min,取上清液,待净化。精密移取5.00 mL上清液加到内含PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg的15 mL塑料离心管中,涡旋混匀1 min,4 ℃、3900 r/min离心10 min,精密量取2.00 mL上清液于7 mL聚乙烯离心管中,40 ℃水浴中氮吹至近干,加入2.00 mL乙腈-水(3∶2)溶液复溶,过0.2 μm滤膜后上机测定。

1.2.3 基质匹配标准溶液的配制 依照1.2.2方法制备样品提取液,以此基质溶液配制成基质匹配标准使用液。

1.2.4 仪器条件 液相色谱条件:色谱柱Water Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),进样量5 μL,柱温30 ℃,流速0.3 mL/min,后运行时间5 min,梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度条件Table 1 Gradient elution process for liquid phase

质谱条件:电喷雾离子源ESI,动态多反应监测(d-MRM),正离子模式,雾化气压力40 psi,干燥器温度350 ℃,干燥气流速10 L/min,毛细管电压4000 V,腔电流:0.28 μA。质谱条件见表2。

表2 44种农药的质谱条件Table 2 Mass spectrometric parameters of 44 kinds of pesticides

1.3 数据处理

采用MassHunter Quantitative Analysis软件处理数据,以MassHunter Quanlitative Analysis和Microsoft Excel 2007软件分析并绘图。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相梯度洗脱条件的确定 以0.1%甲酸水(a)和乙腈(b)为流动相,比较了方案A(0～2 min,90% a;2.1～5 min,90% a→50% a,5～15 min,50% a;15～15.1 min,90% a;15.1～20 min,90% a)和方案B(表1)两种梯度条件下的44种农药d-MRM色谱图(见图1)。从图1可以看出,方案A出峰时间相对集中,峰的重叠会影响各个目标化合物的峰形及其分离效果,导致响应降低。方案B各个化合物依次出峰,分离效果好,峰形改善,响应提高。因此,选择方案B为本实验的最佳梯度洗脱条件。

图1 两种梯度洗脱方案对44种农药出峰的影响Fig.1 Effects of two kinds of gradient elution schemes on the peak of 44 kinds of pesticides

2.1.2 流动相种类的确定 比较了A:乙腈-水,B:乙腈-0.1%甲酸水溶液,C:乙腈-0.1%乙酸水溶液,D:乙腈-0.1%甲酸2 mmol/L乙酸铵的水溶液4种流动相体系下的色谱图(图2)。从图2可以看出,同等测定条件下,流动相体系C下各个目标化合物的响应偏低。当流动相为A、B、D时,从峰的分离度看,在3～5.5 min时间段内,A中色谱峰重叠较多,D中色谱峰响应偏低;流动相A在9～10 min内抑霉唑和甲基硫菌灵未完全分离;11～12min内A中的三种化合物全部分离,B和D中的嘧霉胺和氯吡脲重叠;从色谱峰的整体响应来看,响应强度顺序为B>A>D。因此,综合考虑峰的分离效果和响应情况,选择最佳的流动相种类为乙腈-0.1%甲酸水溶液。

图2 流动相种类对44种农药出峰的影响Fig.2 Effects of mobile phase species on the peak of 44 kinds of pesticides

2.2 质谱条件的优化

将44种农药的单个标准溶液(0.1 μg/mL)采用自动优化和手动优化两种方式对其质谱条件分别进行确定,然后建立全段MRM方法采集44种农药化合物名称和保留时间等信息,利用获得的已知信息转化为动态多反应监测模式(d-MRM),d-MRM的建立可避免不分段采集方式中多个MRM重叠使灵敏度降低的难题,以及分段采集方式中相邻峰在分段处保留时间漂移需在两个段中均设置它们的MRM所带来的降低分析方法通量的缺陷,d-MRM适合多种农药的同时检测,不仅可显著改善多种化合物负载循环时间,还可提高灵敏度和选择性。因此,本文以d-MRM方式建立了44种农药的质谱条件。

2.3 复水量的优化

枸杞干果含水量低,直接用乙腈提取难以充分渗透到样品组织内部,经复水处理后再提取会改变提取效率,因此,比较了10、15、20 mL的复水量对44种农药的提取效果(见图3)。从图3结果可以看出,除噻虫嗪、吡虫啉、甲基硫菌灵和氟苯脲的回收率整体偏低外,当复水量为10 mL时,甲胺磷、乙酰甲胺磷和氧乐果的回收率低于复水量15、20 mL外,其它化合物的回收率范围为64%～119%,从整体回收率水平来看,复水量10、15、20 mL的平均回收率为87.7%、61.9%、61.2%,可能是由于复水量太大,枸杞中的一部分糖类物质溶入水中进而影响净化效果,使得回收率降低。因此,本实验得到最佳的复水量为10 mL。采用液质联用测定枸杞中农药残留,梁月香[13]选择5 g样品的最佳复水量为5 mL;GB 23200.11-2016[14]中规定2 g的加水量为5 mL;本实验中5 g样品的最佳复水量是10 mL,可见,最佳复水量的选择可能与供试样品的干燥程度、含糖量等因素有关。

图3 不同复水量对44种农药化合物的提取效果的影响Fig.3 Effect of different water addition on the extraction efficiency of 44 kinds of pesticide compounds

2.4 提取剂的优化

选取乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、乙酸乙酯为提取剂,通过比较目标化合物的回收率确定最佳提取溶剂(图4)。结果显示,乙酸乙酯对各种化合物的提取回收率在50%左右,提取效果较低。比较乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈提取剂对目标化合物的回收率发现:3种条件下甲基硫菌灵、氧乐果和氟苯脲的回收率均偏低。与乙腈和0.1%乙酸-乙腈相比,0.1%甲酸-乙腈条件下上述化合物的提取回收率较好,且其它化合物的回收率均在60%～120%之间。乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈提取条件下的平均回收率分别为87.79%、88.97%、86.49%,因此,本实验选取的最佳提取溶剂为0.1%甲酸-乙腈。

图4 不同提取剂对44种农药化合物的提取效果的影响Fig.4 Effect of different solvent on the extraction efficiency of 44 kinds of pesticide compounds

2.5 净化条件的优化

以3种不同填料和配比的QuEChERS净化管为净化方案(A:PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg,B:PSA 150 mg、GCB 15 mg、MgSO4885 mg,C:PSA 150 mg、GCB 45 mg、MgSO4855 mg)对44种农药提取液进行净化处理,通过比较化合物的回收率确定最佳净化方案(图5)。从图5可以看出,方案C中各个化合物的回收率不均衡,除了甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、霜霉威的回收率达到80%以上,其它化合物的回收率均较低,无法达到试验要求。方案A和B各个化合物的回收率均在60%～118%之间,平均回收率分别为87.4%和84.5%,均能满足试验要求。PSA主要用于除样品中的极性有机酸和糖类,C18主要用于除去样品中的油脂和类胡萝卜素,GCB主要去除叶绿素等色素,且在萃取极性化合物的回收率较C18更高更稳定[15],方案B中甲胺磷、乙酰甲胺磷等极性化合物的回收率分别为69.8%、80.7%,较方案A的68.7%和79.3%略高;而其余化合物的回收率均低于方案A。综合考虑,本实验以方案A的填料和配比为净化条件。

图5 不同净化条件对44种农药化合物净化效果的影响Fig.5 Effect of different purification conditions on the extraction efficiency of 44 kinds of pesticide compounds

2.6 基质效应的影响

液相色谱-串联质谱法测定农药残留常常会受到样品基质的干扰,本文将枸杞基质溶液和乙腈水溶液分别制备成0.02、0.08、0.16 μg/mL的基质标样和溶剂标样,以基质标样的响应与溶剂标样响应的比值得到基质效应(ME)。当ME>1时,说明基质的存在增强了分析物的响应;当ME<1,则基质的存在抑制了分析物的响应;当ME=1,表示不存在基质效应[16]。结果表明,多数农药呈基质减弱效应,浓度越低,基质减弱效应越明显,尤其是极性强的部分农药,当浓度为0.02 μg/mL时,甲胺磷、噻虫嗪和吡虫啉的基质效应为0.75～0.87,其它化合物的基质效应不太明显,在0.90～1.01之间。随着农药浓度的升高,部分农药反而呈现轻微的基质增强效应。因此,在今后的枸杞农药残留检测中,对于那些基质效应强的农药,建议最好选择基质匹配标曲法进行定量分析[17],对于基质效应不明显的农药,可以用溶剂标曲法定量分析。

2.7 方法学验证

2.7.1 线性方程及检出限、定量限 44种农药在0.002～0.200 mg/L范围内具有良好的线性关系(R2>0.9943),以仪器的3倍和10倍信噪比(S/N)表示方法的检出限和定量限,分别为0.01～3.30和0.03～11.0 μg/kg,均能满足农药残留分析要求。

表3 44种农药化合物的线性关系、检出限和定量限Table 3 Linear relationship,LODs and LOQs for 44 kinds of pesticide compounds

2.7.2 回收率及重复性试验 在枸杞空白样品中分别添加低、中、高(0.04、0.08、0.16 mg/kg)3个浓度水平的加标回收率试验,每个浓度3次平行实验,低、中浓度每个平行重复测定3次,高浓度平行测定6次,各个化合物的加标回收率和相对标准偏差结果见表4。结果显示,44种农药的回收率范围为60.2%～115.3%,相对标准偏差为0.63%～8.27%。部分检验项目的回收率偏低,可能是枸杞基质效应的影响、农药自身极性和稳定性的特点、混标溶液间存在的干扰等多方面因素造成。

表4 44种农药的回收率和相对标准偏差Table 4 Average recoveries and RSDs of 44 kinds of pestcides

2.8 实际样品的测定

在市场随机购买样品20批,共检出农药14种(见表5)。其中多菌灵、啶虫脒、吡虫啉的检出率较高,均达到95%以上;烯酰吗啉和四螨嗪的检出率次之,分别为75%和60%。

从测定结果还可以看出,14种农药的残留水平值均较低,啶虫脒远远低于GB 2763-2016[18]规定的最大残留限量值1 mg/kg。本实验中检出率高的三种农药,与王莹[19]和蒋玉宝[20]报道的结果相一致。

表5 实际样品的测定Table 5 Determination of actual samples

3 结论

本实验采用0.1%甲酸-乙腈提取,PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg分散固相萃取净化,经T3色谱柱分离,0.1%甲酸水和乙腈流动相体系梯度洗脱,采用电喷雾的动态多反应监测模式检测,基质匹配标准曲线的外标法定量,建立了同时测定枸杞中44种农药残留的高效液相色谱-串联质谱的分析检测方法。结果表明,各农药在浓度范围内的线性关系良好,决定系数均大于等于0.9943,三个添加水平的回收率范围为60.2%～115.3%,相对标准偏差为0.63%～8.27%,检出限范围为0.01～3.30 μg/kg。本方法操作简单,准确度和精密度高,适合枸杞中多种农药残留的定性和定量检测,可为农药残留的监控和风险评估提供了一种快速高效的分析手段。