基于网络药理学探讨牛膝对骨关节炎的作用机制

2020-02-17董海鹏孟凯

世界最新医学信息文摘 2020年1期

董海鹏，孟凯

（1.山东中医药大学硕士研究生，山东济南；2.山东中医药大学附属医院，山东济南）

0 引言

骨关节炎（osteoarthritis，OA）中医属于学“筋痹”“痹证”等范畴，是一种常见的慢性关节疾病[1]，膝关节最为常见[2]。原发性骨关节炎的发病原因迄今尚未完全明确，一般认为是多种致病因素包括机械性和生物性因素的相互作用所致。其中年龄是主要高危因素，其他因素包括外伤、肥胖、遗传、炎症等。女性发病率较高，在绝经后明显增加，且与关节软骨中发现雌激素受体有关。骨质疏松因软骨下骨小梁变薄变硬时，其承受压力的能力下降，因此出现骨关节炎的几率较高。

中药牛膝属多年生草本，根入药。性味：苦、甘、酸，平。归肝、肾经。具有逐瘀通经，补肝肾，强筋骨，利尿通淋，引血下行的功效。《神农本草经》牛膝味苦、酸。主寒，湿痿痹，四肢拘挛，膝痛不可屈伸，逐血气伤。临床上常用牛膝配伍杜仲、桑寄生等治疗骨关节炎，并有一定功效[3-5]。牛膝具有多成分、多靶点的调节的作用。

1 材料与方法

1.1 牛膝化学成分及作用基因靶点、骨关节炎基因靶点信息获取

采用中药系统药理学技术平台（TCMSP）检索牛膝的化学成分及靶点。根据口服生物利用度（OB）＞30% 和类药性（DL）＞0.18，筛选牛膝中的活性成分及其相关作用基因靶点。通过Genecard、OMIN 数据库，输入关键词“osteoarthritis”获取与骨关节炎相关靶点。

1.2 网络的构建

利用R 语言绘制将牛膝活性成分相关的靶点和疾病靶点进行匹配，获得牛膝活性成的潜对骨关节炎有作用的靶点，即两者共同基因即为牛膝-骨关节炎的关键靶点。采用Cytoscape 软件（Version3.7.1）构建“疾病-药物-活性成分-基因靶点”关系网络图。网络图中蓝色节点代表疾病与药物活性成分的关键基因靶点，网络图中草绿色节点是药物活性成分，通过构建这一网络图探析牛膝对骨关节炎的作用机制。

1.3 关键靶点蛋白相关作用网络的构建

利用STRING 数据库平台预测的蛋白相互作用关系。将牛膝-骨关节炎的关键基因靶点导入String 数据库，研究物种为选择为人类（Homo sapiens），获得蛋白互作关系，并将结果以TSV 格式导出。

1.4 关键基因靶点本体（gene ontology,GO）

富集分析和基因相互作用（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路，分析利用Bioconductor 平台和R 语言对获得的基因进行GO 富集分析和KEGG 通路分析。首先在R 中进行安装包的安装，安装包包括"colorspace"、"stringi"、"DOSE"、"clusterProfiler"、"pathview"导出GO 富集分析表格，并绘制dotplot 点图。KEGG 通路富集分析的安装语言同上，可导出KEGG 富集分析表格，KEGG 通路图，并绘制dotplot 点图。

2 结果

2.1 牛膝活性成分的通过

TCMSP 平台数据库检索，且OB＞30% 和DL＞0.18，筛选得到牛膝潜在活性成分，见表1。

表1 牛膝中潜在活性成分

2.2 牛膝活性成分对骨关节炎的潜在作用靶点预测

通过TCMSP 平台数据库检索，筛选活性成分对应的潜在作用靶点，去除无效和重复靶点后，得到牛膝潜在活性成分的作用靶点100 个。利用Genecard 数据库、OMIM 数据库平台，检索“osteoarthritis”，共得到骨关节炎疾病的潜在作用靶点2397 个。利用R 语言获得共同基因靶点为63 个（表2）。

2.3 疾病-药物-活性成分-基因靶点网络构建与分析

牛膝与骨关节炎作用靶点相关的药物的潜在活性成分有16个，为poriferasta-7，22E-dien-3beta-ol、28-norolean-17-en-3-ol、berberine、coptisine、wogonin、delta 7-stigmastenol、baicalein、epiberberine、beta-sitosterol、Inophyllum E、kaempferol、Spinasterol、Stigmasterol、palmatine、beta-daucosterol_qt、quercetin。活性成分、基因靶点导入 Cytoscape 软件进行网络构建及可视化（图1）。结果表明， quercetin、kaempferol、wogonin 等连接度较高，以上成分是牛膝治疗骨关节炎的重要成分。

2.4 基因靶点蛋白质相互作用网络分析

将牛膝- 骨关节炎的63 个潜在的关键基因靶点导入String数据库平台，选择物种为人类，获取蛋白质相互作用关系并绘制蛋白关系网络（图2）。排除2 个游离的无相互作用蛋白，该网络图共包括63 个节点，578 个边。其中综合数值最高，评分＞0.99 的相互作用蛋白为IKBKB、CASP8、RELA、CASP9、CYP1A1、IKBKB、IGF2、VEGFA、BCL2、BIRC5、CASP3、CASP8、CAV1、VEGFA、CAV1，这些蛋白之间的相互作用在网络中具有重要地位，这些基因靶点在牛膝对骨关节炎治疗中具有重要意义。

2.5 基因靶点生物功能及通路分析

GO 富集分析结果显示，牛膝的63 个潜在关键基因靶点的GO富集排名靠前的生物学功能主要为DNA 结合转录激活因子活性，RNA 聚合酶II 特异性（15 个靶点PGR、ESR1、AR、RELA、TP63、FOS、HIF1A、FOSL1、NR1I3、ELK1、MYC、NFE2L2、PARP1、RUNX2、IRF1），RNA 聚合酶II 近端启动子序列特异性DNA 结合（14 个靶点PGR、ESR1、AR、PPARG、RELA、HIF1A、FOSL1、AHR、ESR2、ELK1、MYC、HSF1、RUNX2、IRF1），近端启动子序列特异性DNA 结合（14 个靶点PGR、ESR1、AR、PPARG、RELA、HIF1A、FOSL1、AHR、ESR2、ELK1、MYC、HSF1、RUNX2、IRF1），蛋白质异二聚活性（13 个靶点PPARG、RELA、BCL2、MCL1、VEGFA、FOS、HIF1A、AHR、IKBKB、EGFR、ERBB2、CAV1、HSF1），核受体活性（7 个靶点PGR、ESR1、AR、PPARG、AHR、ESR2、NR1I3）转录因子活性（7 个靶点PGR、ESR1、AR、PPARG、AHR、ESR2、NR1I3）RNA 聚合酶II 转录因子结合（7 个靶点ESR1、AR、GSK3B、FOS、AHR、ELK1、NFE2L2）等（图3），表明牛膝就可以通过参与调控多种生物学过程而发挥抗骨关节炎作用。

KEGG 通路富集分析显示，牛膝的关键基因靶点主要富集的通路为卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染，人巨细胞病毒感染，乙型肝炎，细胞凋亡，流体剪切应力与动脉粥样硬化，糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路，麻疹，前列腺癌，TNF 信号通路等。牛膝的活性成分分布于多个通路，可通过各通路协调发挥抗骨关节炎作用（图4）。

3 讨论

牛膝是临床治疗骨关节炎的常用中药，其提取物具有保护软骨细胞作用[6,7]。牛膝总皂苷能有效抑制OA 滑膜炎症，改善关节粘连度，降低滑膜组织β-catenin 蛋白表达以及减少关节液TNF-1，IL-1β，MMP-3 因子含量[8]。牛膝总皂苷含药关节液能有效提高细胞活力、促进软骨细胞增殖、提高Ⅱ型胶原蛋白表达，且降低软骨细胞早期、晚期凋亡率[9]。牛膝醇提物能有效刺激软骨细胞增殖，修复软骨损伤，降低软骨[10]。本研究旨在对牛膝治疗骨关节炎的分子机制作初步探讨，为临床治疗提供依据。研究表明牛膝与骨关节炎的相关成分16 个，共同作用靶点63 个，主要通过调控PGR、PPARG、PTGS1、AR、BCL2、CASP3、ESR1 等靶基因，通过卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染，人巨细胞病毒感染，乙型肝炎，细胞凋亡，流体剪切应力与动脉粥样硬化，糖尿病并发症中的AGERAGE 信号通路，麻疹，前列腺癌，TNF 信号通路等调节。研究表明，其中活性成分黄连素（coptisine）对骨关节炎关节软骨基质降解因子MMP-13 及ADAMTS-5 的表达有抑制作用，对骨关节炎软骨结构具有一定的改善作用[11]。槲皮素（quercetin）能够显著促进IL-1β 体外诱导兔软骨细胞的增殖[12]，可显著降低MMP-13/TIMP-1 的比例，促进抑制软骨细胞外基质的降解[13]，促进对关节软骨的保护。综上所述，本研究应用网络药理学方法，对牛膝药治疗骨关节炎的作用机制进行初步探讨，结果表明了牛膝的主要潜在活性成分及作用靶基因与骨关节炎作用通路的关系，为进一步深入探讨其作用机制提供了新思路。