黄亮，赵宇辉，孙忠人，盛国滨，李晓宁，倪金霞，李雪岩，戴缙，王迪★

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨；2.深圳市龙华区中心医院，深圳；3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨；4.北京中医药大学东直门医院，北京）

0 引言

震颤麻痹多见于老年人，随着中国人口不断地老龄化，震颤麻痹的发病率日益增长。患有震颤麻痹的老年人逐渐丧失行动力、生活自理能力，给家庭及社会带来了负担。震颤麻痹的病理改变主要表现在多巴胺神经元的变性、缺失。研究发现，震颤麻痹大鼠黑质神经元发生明显凋亡现象[1]。本实验研究在电镜下观察各组大鼠黑质及纹状体的病理形态学改变，观察了电针舞蹈震颤区对震颤麻痹大鼠黑质神经细胞凋亡的影响，旨在探究电针治疗震颤麻痹的作用机制，为临床应用电针治疗震颤麻痹提供基础实验佐证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

100 只雄性成年SPF 级SD 大鼠，（250±20）g 体重。实验动物由黑龙江中医药大学动物实验管理中心提供。所有实验用鼠常规适应性饲养1 周，自由饮食、饮水，实验所有过程符合动物伦理实验标准。

1.1.2 主要试剂与药物

6- 羟基多巴胺（6-OHDA）（美国Sigma 公司）；阿朴吗啡（APO）（美国Sigma 公司）；戊巴比妥钠（德国Merck 公司）；4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司）；戊二醛（北京索莱宝科技有限公司）；TUNEL 检测试剂盒（美国Sigma 公司）；蛋白酶K（美国Sigma 公司）；左旋多巴（上海福达制药有限公司）。

1.1.3 主要仪器

脑立体定位仪（美国stoelting 公司）；德国LEICA 公司生产的EG1160 组织包埋机和RM2235 型切片机；日本奥林巴斯公司生产的CX41 奥林巴斯显微镜；日本JVC 公司的TK-C9201EC 型摄像头；透射电子显微镜（日本）；KWD-808 Ⅱ型全能脉冲电疗仪。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

利用行为学筛选造模成功的大鼠36 只，随机分为模型组、电针组、左旋多巴药物组3 组，每组12 只，并设立正常组及假手术组2 组，每组12 只大鼠。正常组给予常规饲养；假手术组仅手术，不注射6-OHDA；模型组造模完成后不给予治疗；电针组给予电针治疗；左旋多巴药物组给予口服左旋多巴治疗。

1.2.2 动物模型建立

采用右侧偏侧帕金森模型，造模前用0.3%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，待大鼠角膜反射消失后，将大鼠固定于立体定位仪上。在无菌环境中沿正中矢状线切开大鼠颅顶部皮肤，剥离皮下组织及骨膜，暴露前囟、人字缝，按Pellegrino LJ[2]等编著的大鼠脑立体定位图谱确定右侧黑质两注射点位坐标：第1 点为前囟后3.0mm，正中线右侧2.5mm，硬脑膜腹侧8.6mm；第2 点为前囟后2.4mm，正中线右侧2.7mm，硬脑膜腹侧8.6mm。以鼠颅骨钻按上述坐标钻直径为5mm 的孔。用10μL 微量进样器以1μL/min 速度向嘴侧注射4μL 6-OHDA、向尾侧注射3μL 6-OHDA，每次注射完成后留针10min，然后以1.0mm/min 的速度缓慢退针，再用明胶海绵填塞颅骨孔，对切开进行缝合。造模完成后2 周腹腔注射APO 诱发旋转行为（向健侧旋转），注射10min 后开始记录，共记录30min，旋转速度达到6 转/min 视为模型制备成功[3]。

1.2.3 治疗方法

电针组大鼠给予电针治疗。在右侧舞蹈震颤区上点与下点采用0.25mm×25mm 毫针进行针刺，连接KWD-808 Ⅱ型全能脉冲电疗仪，电针波形选择疏密波（频率为1Hz），调节电流强度至头部皮肤轻微颤动，每次治疗30min，每日治疗1 次，共治疗20 天。左旋多巴药物组给予左旋多巴1.0mg 灌胃给药，每日治疗1 次，共治疗20 天。

1.2.4 标本制备

治疗结束后用0.3%戊巴比妥钠（10mL/kg）进行腹腔麻醉，灌注固定后，每组选取6 只大鼠取脑内黑质置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋备用；余大鼠取脑内黑质及纹状体置于戊二醛中固定备用。

1.3 检测指标

1.3.1 病理形态学

透射电镜下观察大鼠黑质、纹状体组织结构变化。

1.3.2 TUNEL 检测

利用TUNEL 检测法观察各组大鼠黑质神经细胞凋亡情况。具体操作：切片置于二甲苯溶液中5min×2 次；再水化处理；蛋白酶K 培育30min；PBS 冲洗5min×2 次；平衡缓冲液37℃保湿盒培育2h；PBS 冲洗5min×2 次；封闭；链霉亲和素HRP 培育30min；PBS 冲洗5min×2 次；DAB 显色，镜检。利用图像分析软件测定各组大鼠黑质阳性细胞数目的平均光密度。

1.4 统计学处理

统计分析处理采用SPSS 19.0 软件进行，用均数±标准差表示所有数据，分析不同组采用单因素方差，采用t 检验组间比较，P＜0.05 有统计学差异。

2 结论

2.1 透射电镜观察结果

正常组、假手术组大鼠黑质及纹状体神经细胞结构清晰，胞体饱满，核仁明显，胞质内可见粗内质网、线粒体等细胞器；模型组大鼠黑质及纹状体神经细胞胞体皱缩，可见粗内质网扩张，溶酶体增多，线粒体肿胀；电针组、左旋多巴药物组大鼠黑质及纹状体神经细胞胞体略缩小，粗内质网轻度扩张，偶见线粒体结构被破坏。

2.2 各组大鼠黑质神经细胞凋亡情况

TUNEL 检测中，凋亡细胞核染色呈棕黄色或棕褐色，正常细胞核为蓝色。实验结果显示：与正常组、假手术组相比较，模型组、电针组、左旋多巴药物组神经细胞凋亡数量明显升高；与模型组相比较，电针组和左旋多巴药物组神经细胞凋亡数量显著下降，电针组和左旋多巴药物组相比，无统计学差异。见表1。

表1 各组大鼠黑质神经细胞凋亡的平均光密度（IOD/AREA）

3 讨论

中国人口老龄化不断加重，致使震颤麻痹的发病率也在逐年上升。震颤麻痹不仅给患病者带来了巨大的痛苦，也给患病者的家庭和社会带来了沉重的经济负担。因此寻求一种简便、有效的治疗方法刻不容缓。祖国医学历史悠久，针灸在治疗疾病方面有其独有的优势。针灸不仅临床疗效显著，而且还具有操作简便、毒副作用小等特点。电针治疗更是在毫针针刺的基础之上，通过施以微量的电流起到治疗疾病的效果。研究表明，电针波形中的疏密波能够促进血液循环，促进组织代谢，改善机体营养，抑制细胞凋亡。因此，本研究采用电针治疗震颤麻痹，观察电针对震颤麻痹大鼠脑组织的影响，探究电针治疗震颤麻痹的作用机制。

目前，震颤麻痹的发病机制尚未完全明确。大量实验研究表明，震颤麻痹与多巴胺能神经元凋亡密切相关[4]。细胞凋亡属于机体的一种程序性死亡，这种死亡模式不仅受基因的支配，同时也因外界不良刺激而启动。细胞凋亡可由自由基、炎性因子、脂质过氧化反应等外界刺激诱发进行，而震颤麻痹在发病过程中均会引起上述病理改变。本实验研究发现，与正常组、假手术组相比较，模型组、电针组、左旋多巴药物组神经细胞凋亡数量明显升高（P＜0.05）；与模型组相比较，电针组和左旋多巴药物组神经细胞凋亡数量显著下降（P＜0.05），说明电针能够通过抑制细胞凋亡对震颤麻痹大鼠黑质神经元起保护作用，这可能是电针治疗震颤麻痹的作用机制之一。且电针组与左旋多巴药物组相比较，对上述二者的影响不具有统计学意义，说明电针治疗与药物治疗的疗效接近。且相比应用药物治疗，电针治疗不存在耐药性及毒性等问题。电针治疗震颤麻痹不仅具有较好的临床疗效，更有动物实验研究作为其临床应用的佐证，具有良好的应用前景。