李冰 云哲琳 董长城

研究发现，PD1/PD-L1信号通路主要作用于细胞的增殖和分化过程，由于肿瘤细胞的增殖及分化过程均有别于正常细胞，故该通路与多种肿瘤的发生和发展密切相关[1-3]。有研究发现PD1和PD-L1在胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤中存在高表达，其可能参与疾病发生和发展过程[4-6]。但关于PD1和PD-L1在肝癌中的表达及意义的研究鲜见。本研究对肝癌组织中PD1和PD-L1的表达水平进行分析，并探讨其与病理特征间的相关性。

资料与方法

一、一般资料

选取2015年1月-2018年12月内蒙古包钢医院就诊的80例肝癌患者作为研究对象。排除：排除标准为：合并重大恶性肿瘤者；合并精神疾病、心理疾病患者。其中男38例，女42例；年龄21～65岁，平均年龄(37.3±2.9)岁; 肿瘤直径(0.4～6.8 cm)，平均肿瘤直径(3.32 ± 0．22) cm。本研究获得医院伦理委员会批准，所有患者自愿签署知情同意书。

二、方法

(一)RT-PCR检测 PD1和PD-L1 mRNA的表达水平 提取总RNA，逆转录， SYBR green染料法进行定量，以GAPDH基因为内参。引物：(PD1-F: 5′-ATCTCACCGCTCGTTT-CCT-3′ ; PD1-R: 5′-CACTGCAAACCTCGGTGATG-3′; PD-L1-F: 5′-GGTA ATCCGTTTCCCTTGA-3′ ; PD-L1-R: 5′-CCTAATTTATGAGCC-TATC-3′ ; GAPDH-F: 5′-GGTAG-AACGTCCGTGTTTCA-3′ ; GAPDH-R: 5′-TTCAGTCCCA-GTCATGGAAC-3′)。

PCR反应程序:在98 ℃下进行30 s的预变性，接着在98 ℃下进行10 s的变性，再在50 ℃下进行30 s的退火，最后在72 ℃下进行45 s延伸，一共进行35个循环。

(二) Western blot检测和PD1和PD-L1蛋白的表达水平 采用BCA试剂盒测定蛋白质含量，上样20 μg，凝胶电泳，转膜，封闭2 h，分别孵育PD1和PD-L1一抗，4℃过夜，洗膜，孵育二抗，显影。

(三)免疫组化检测PD1和PD-L1蛋白表达水平 所有肾透明细胞癌患者的肿瘤组织作为肾透明细胞癌组标本，其相应的临近非肿瘤组织样本(距离肿瘤组织2 cm以上)作为非肿瘤组织组标本。取病理石蜡标本，切片6张。用5%血清进行室温封闭40 min后，加入1∶1 000的单克隆抗体4℃过夜孵育。……