范旋燕，孙锦辉，黄帅，叶石才，喻才元，周宇，全娟花

（广东医科大学附属医院 消化内科，广东 湛江 524001）

结肠癌的发病率呈逐年升高趋势，当前治疗手段以手术结合化疗为主，辅以基因治疗、靶向治疗等，但随治疗时间延长及耐药细胞的出现，其疗效并不理想[1]。JS-K 作为一氧化氮前体药物通过与细胞内谷胱甘肽-S-转移酶结合并释放一氧化氮，进而调控机体多种生命活动，包括舒张血管、抗病毒及抗肿瘤等[2-4]。JS-K 对多种肿瘤细胞增殖有抑制作用，但对人结肠癌细胞HCT116 的影响尚未明确。本研究采用不同浓度JS-K 处理HCT116 细胞，观察其对细胞增殖及凋亡的影响，为临床治疗人结肠癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

JS-K（西格玛奥德里奇上海贸易有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（乌拉圭Lonsera 公司），100X 抗菌-抗真菌剂、0.25%胰蛋白酶（美国Gibco 公司），RPMI 1640 培养基（美国Hyclone 公司），细胞冻存液CELLBANKER 2（日本ZENOAQ 公司），Trizol、Texas Red-X 鬼笔环肽（美国Life Technology公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR） 引 物（ 上海生工生物工程股份有限公司），M-MLV cDNA 合成试剂盒、酶标仪及细胞培养箱（中国赛默飞世尔科技有限公司），CellTiter 96®AQueous 单溶液细胞增殖检测试剂盒（北京普洛麦格生物技术有限公司），细胞周期检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司），Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide,PI）凋亡检测试剂盒（日本Dojindo 公司），抗荧光淬灭封片剂封片（美国Vector Laboratories 公司），倒置荧光显微镜（日本Olympus 公司），FACS Canto II 流式细胞仪（美国BD 公司）。

1.2 细胞培养

将人结肠癌细胞株HCT116（北京北纳创联生物科技有限公司）接种于10 cm 培养皿，培养体系为含10% FBS、1%抗菌-抗真菌剂（青霉素、链霉素JI 两性霉素B）的RPMI 1640 培养基，使用饱和湿度细胞培养箱于37℃、5%二氧化碳CO2环境下培养，待细胞融合度达70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化、传代后冻存备用。

1.3 JS-K 对HCT116 细胞增殖的影响

将对数生长期的HCT116 细胞，按每孔3 000 个细胞均匀接种于96 孔板中，待细胞贴壁12 h 后，加入含有不同浓度JS-K 的培养基100μl，使培养体系JS-K 药 物浓 度 分别 为0.0、1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L，并分别作为0.0、1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L 组。各组设置5 个复孔，分别处理12、24、48 及72 h 后检测细胞增殖情况。参照MTS 说明书，于不同时间点加入20μl/孔MTS，在37℃培养箱中孵育2 h，酶标仪测定490 nm 处的吸光度，计算细胞增殖抑制率。

1.4 细胞周期检测

取对数生长期的HCT116 细胞接种于6 孔板中（3×105个/孔），培养12 h 后，用不同浓度JS-K 处理细胞48 h，用PI 单染色流式细胞术检测细胞周期收集各组上清液，贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min 离心10 min，预冷磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）重悬细胞，离心沉淀细胞，弃上清液，预留50μl PBS，用预冷75%乙醇于4℃固定过夜。用预冷PBS 洗涤、重悬细胞后转移至流式管，每管加入20μl RNase A Solution，37℃水浴30 min，每管加入400μl PI Staining Solution，轻轻混匀，4℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测。

1.5 细胞凋亡检测

参照1.4 的方法收集细胞，加入500μl 预先配好的1×Annexin V Binding Buffer 重悬细胞，使细胞浓度为1×106个/ml。取100μl 细胞悬液到流式管中，每管加入5μl FITC Annexin V 和PI 溶液，室温避光孵育15 min。补加400μl 1×Annexin V Binding Buffer，用流式细胞仪检测。

1.6 细胞形态观察

将对数生长期的HCT116 细胞接种于置有灭菌盖玻片的12 孔板（8×104个/孔），培养12 h 后，不同浓度JS-K 处理细胞48 h，弃培养基，用预冷PBS 洗涤2 次，加入免疫荧光固定液室温固定30 min。用0.1% Triton X-100 透化10 min，免疫荧光洗涤液洗2 次，滴加200μl Texas Red-X 鬼笔环肽（1 ∶100 稀释），暗盒室温放置30 min，染色细胞骨架。用10μl DAPI 抗荧光淬灭封片剂封片，在倒置荧光显微镜下观察细胞形态。

1.7 凋亡基因mRNA 表达检测

取对数生长期的HCT116 细胞接种于10 cm 培养皿（2.5×106个/皿），培养12 h，不同浓度JS-K 处理细胞48 h。用Trizol试剂提取样本总RNA，利用M-MLV试剂盒合成cDNA。设计引物并用10μl qRT-PCR 反应体系进行扩增（见表1）。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法分析基因转录水平。

1.8 统计学方法

数据分析采用Graphpad Prism 7.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步的两两比较用LSD-t法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 Bcl-2 家族凋亡基因引物序列

2 结果

2.1 各组HCT116 细胞的生长抑制率比较

不同浓度JS-K处理HCT116 细胞12、24、48及72 h 后，检测细胞生长抑制率，采用重复测量设计的方差分析，结果如下：①不同时间点细胞生长抑制率比较，差异有统计学意义（F=364.450，P=0.000）；②各组HCT16 细胞生长抑制率比较，差异有统计学意义（F=138.237，P=0.000）；③各组细胞生长抑制率的变化趋势比较，差异有统计学意义（F=29.835，P=0.000）。在同一时间点，HCT116 细胞的生长抑制率随JS-K 浓度的增加而升高；在JS-K 浓度相同时，HCT116 细胞的生长抑制率随暴露时间的延长而升高，提示JS-K 对HCT116 细胞增殖的抑制作用呈剂量-时间依赖性。见表2和图1。

表2 各组HCT116 细胞生长抑制率比较 （%，±s）

表2 各组HCT116 细胞生长抑制率比较 （%，±s）

组别 12 h 24 h 48 h 72 h 0.0μmol/L 组 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 1.0μmol/L 组 7.19±2.20 7.86±3.96 16.49±6.87 17.17±7.03 2.5μmol/L 组 10.47±1.95 15.21±6.05 33.71±7.31 57.53±4.48 5.0μmol/L 组 12.03±2.54 19.97±4.73 49.53±7.26 68.16±5.92 10.0μmol/L 组 13.78±2.59 23.09±5.61 58.93±5.43 76.04±3.74 20.0μmol/L 组 14.96±2.15 32.43±6.47 63.26±3.69 85.03±6.08

图1 各组HCT116 细胞生长抑制率的变化趋势 （±s）

2.2 不同浓度JS-K 对HCT116 细胞周期的影响

各组G0/G1 期细胞比例比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；1.0、2.5、5.0、10.0及20.0μmol/L 组G0/G1 期细胞比例较0.0μmol/L 组下降。各组G2/M 期细胞比例比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L 组G2/M 期细胞比例较0.0μmol/L 组上升，提示JS-K可阻滞HCT116细胞G2/M 期。见表3和图2。

表3 各组G0/G1 期、G2/M 期HCT116 细胞比例比较 （%，±s）

表3 各组G0/G1 期、G2/M 期HCT116 细胞比例比较 （%，±s）

组别 G0/G1 期 G2/M 期0.0μmol/L 组 74.66±5.99 4.89±1.16 1.0μmol/L 组 71.53±5.67 8.52±1.50 2.5μmol/L 组 62.87±2.76 12.91±2.06 5.0μmol/L 组 51.13±4.85 26.47±2.35 10.0μmol/L 组 4.38±1.36 74.78±9.33 20.0μmol/L 组 1.51±0.60 84.05±7.38 F 值 194.386 143.089 P 值 0.000 0.000

图2 JS-K 处理HCT116 细胞48 h 后周期分布

2.3 各组细胞晚期凋亡率比较

0.0、1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L 组 细 胞晚期凋亡率分别为（5.4±0.8）%、（28.8±3.0）%、（31.1±2.3）%、（35.2±6.1）%、（36.9±4.5）% 和（71.6±6.9）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=71.069，P=0.000）。进一步两两比较，1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L 组细胞晚期凋亡率逐渐递增，且均高于0.0μmol/L 组（P＜0.05），提示JS-K呈浓度依赖性促进HCT116 细胞的晚期凋亡。见 图3。

图3 细胞凋亡流式细胞图

2.4 不同浓度JS-K 对HCT116 细胞核及细胞骨架微丝结构的影响

0.0μmol/L 组细胞微丝结构分布相对均匀，相互连成网状，周围边界清晰，有少量微丝触角。JS-K 处理后，DAPI 染色呈核浓缩，核碎裂成大小不等的圆形小体；细胞骨架微丝网状结构不清晰，局部呈现溶解或者断裂现象。以上结果提示，JS-K 可诱导HCT116细胞核碎裂及改变骨架微丝结构的分布。见图4。

图4 HCT116 细胞核及细胞骨架微丝结构变化

2.5 各组Bcl-2 家族基因 mRNA 相对表达量 比较

各 组Bax、Bik、Bim、Puma、Bcl-xL 和Mcl-1 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。0.0、1.0、2.5 和5.0μmol/L 组Bax、Bik 及Bim mRNA 相对表达量呈上升趋势；5.0μmol/L 组Puma mRNA 相对表达量最高；0.0、1.0、2.5 和5.0μmol/L 组Bcl-2 和Bcl-xL mRNA 相对表达量呈下降趋势；5.0μmol/L 组Mcl-1 mRNA 相对表达量最低。见表4和图5。

表4 各组Bcl-2 家族基因mRNA 相对表达量比较 （±s）

表4 各组Bcl-2 家族基因mRNA 相对表达量比较 （±s）

组别 Bax Bik Bim Puma Bcl-2 Bcl-xL Mcl-1 0.0μmol/L 组 1.01±0.22 1.01±0.15 1.02±0.23 1.01±0.17 1.01±0.20 1.01±0.17 1.00±0.10 1.0μmol/L 组 1.08±0.14 1.19±0.17 1.07±0.08 0.95±0.13 0.99±0.56 0.99±0.134 1.25±0.14 2.5μmol/L 组 1.67±0.16 1.22±0.09 1.16±0.19 1.29±0.30 0.94±0.24 0.91±0.10 0.89±0.15 5.0μmol/L 组 2.36±0.32 1.82±0.11 1.75±0.18 2.14±0.64 0.83±0.16 0.58±0.09 0.46±0.05 F 值 23.761 21.934 10.937 6.541 0.6593 7.208 24.54 P 值 0.000 0.000 0.003 0.015 0.600 0.012 0.000

图5 各组Bcl-2 家族基因mRNA 相对表达量比较 （±s）

3 讨论

结肠癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤，在世界范围内严重威胁着人类的身心健康。尽管随着各项研究的深入和技术的进步，结直肠癌的诊断和治疗手段都有了显著提高，但是肿瘤诊断和治疗仍然面临诸多挑战[5]。临床治疗以根治手术联合化疗为主，但患者的5年生存率仍不理想，多药耐药性是影响结直肠癌患者化疗疗效的主要原因[6]。因此，开发高效、低毒的药物是治疗肿瘤的有效途径之一。有研究报道，一氧化氮前体药JS-K 对前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病、多发性骨髓瘤及神经胶质母细胞瘤等生长有抑制作 用[3，7-12]。本研究结果表明，JS-K 对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡有明显影响，且呈浓度依赖性。

有研究报道，JS-K 可抑制白血病细胞G2/M 期，诱导细胞早期凋亡[13]。本研究显示，JS-K 主要阻滞HCT116 细胞G2/M 期，并诱导晚期凋亡，且呈浓度依赖性。细胞凋亡时细胞骨架发生相应变化，表现为微丝结构降解凝集和分布不均匀[14]。本研究荧光双标记结果提示，JS-K 处理HCT116 细胞后，诱导核浓缩和核碎裂；细胞微丝结构和分布发生变化，局部出现溶解或断裂现象，表明JS-K 促进HCT116 细胞凋亡。

JS-K 主要通过诱导细胞凋亡对肿瘤细胞产生抑制作用，在调控凋亡的众多基因中，Bcl-2 家族与凋亡发生、发展最为密切。Bcl-2 家族分为2 大类：一类是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL 及Bcl-w 等；另一类是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bid、Bik 及Bad等[15]。LIU 等[16]发现，JS-K 通过Bcl-2 家族蛋白调控诱导人肝癌HepG2 细胞凋亡。本研究结果提示，JS-K可通过上调促凋亡蛋白Bax、Puma，下调抗凋亡蛋白Mcl-1 蛋白表达，促进HCT116 细胞凋亡。

综上所述，本实验证实JS-K 对人结肠癌细胞HCT116 增殖有明显抑制作用，同时JS-K 通过上调HCT116 细胞中Bax 和下调Bcl-2 表达，阻滞细胞G2/M 期，促进细胞的晚期凋亡。目前证实JS-K 通过以下3 条途径抑制肿瘤细胞：①MAPK/JNK 通路；②Wnt/β-catenin 信号通路；③胱天蛋白酶信号通路。其中胱天蛋白酶信号通路是JS-K 诱导凋亡最重要的信号通路，JS-K 诱导人结肠癌细胞HCT116 凋亡的作用机制还有待研究。