张岚，周利娟，肖旭阳

（1.锦州医科大学附属第一医院 胸外科，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学 护理学院，辽宁 锦州 121000）

尽管近20年来癌症治疗技术得到了快速发展，但是食管癌患者预后依然不甚理想，我国食管癌 5年生存率仅为30%[1-3]。寻找有效指标用于判断患者预后具有重要意义。Rab3A 相互作用蛋白（Rab3A interacting protein,Rab3IP）首次在Hela 细胞中发现，与SSX2 共同锚定于细胞核，与肿瘤细胞的形成密切相关。有研究发现胃癌、涎腺癌组织中Rab3IP 表达明显上调，并且与患者不良预后密切相关[4-5]。本研究通过分析Rab3IP 表达与食管癌患者临床资料的关系，探讨Rab3IP 对食管癌预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年7月—2018年7月于锦州医科大学附属第一医院行食管癌根治性切除术的109例食管癌患者。所有患者经术后病理学证实为食管癌，术前未行放化疗或其他抗癌治疗，临床资料完整，有随访记录。排除围手术期严重并发症或术中死亡患者。其中男性62例，女性47例；年龄45 ～79 岁，平均（61.17±7.15）岁。患者临床分期参考国际抗癌联盟与美国癌症联合会食管癌病理分期标准（第8 版）[6]，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期患者分别有15、35 及59例。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者术前均被详细告知手术风险和受益，并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 所有患者术中同时切取癌组织及其癌旁组织，癌组织为距肿瘤切缘＜1 cm，病理证实为食管癌组织；癌旁组织为距肿瘤切缘≥2 cm，病理证实为正常食管组织。样本组织取出后，立即置于液氮冷冻，再置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 免疫组织化学法 取出样本组织，自然融化，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成5μm 切片。切片常规脱蜡、水化后，加入3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，10%正常羊血清孵育20 min。滴加兔抗人RAB3IP 多克隆抗体（1 ∶100，美国Abcam 公司），4℃冰箱中过夜。次日磷酸盐缓冲液振荡清洗后滴加生物素标记山羊抗兔免疫球蛋白G 抗体（上海碧云天生物技术研究所，二抗），孵育1 h，DAB 显色，苏木精复染，常规脱水、透明后，中性树脂封片。由2 位病理科医生阅片，染色半定量分析Rab3IP 表达，染色强度：无染色计0 分，淡黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分。阳性细胞所占面积比：无阳性细胞计0 分，＞0%～10%计1 分，＞10%～50%计2 分，＞50%计3 分。将染色强度与阳性细胞所占面积比之积为最终染色评分，Rab3IP 评分≤3 分为低表达，＞3 分为高表达，并分别作为低表达组和高表达组。

1.2.3 Western blotting 从109 份食管癌组织和配对的癌旁组织中随机选择3 份进行Western blotting 检测。取约200 mg 样本组织，冰浴上打成匀浆，4℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清液，BCA 法检测蛋白含量。加入上样缓冲液将蛋白煮沸5 min 变性，取50μg 总蛋白SDS-PAGE 电泳分离，电泳后半干法转移至PVDF，5%脱脂奶粉孵育2 h。PBST 洗膜后加入Rab3IP 抗体（1 ∶250，美国Abcam 公司），4℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化酶标记的二抗（1 ∶1 000，武汉博士德生物工程公司）振荡孵育2 h，回收二抗，TBST 洗膜3 次，用伯乐凝胶成像仪进行条带成像与分析。

1.2.4 资料收集 收集患者临床资料，包括性别、年龄、肿瘤大小、病灶部位、分化程度、侵袭深度、淋巴结转移及TNM 分期等。查阅患者随访资料，术后患者进行常规随访，术后第1 ～2年每3 个月随访 1 次；术后3 ～5年每6 个月随访1 次。生存时间从手术当天开始计算，截止日期为死亡日期或末次随访日期，本研究随访截止日期为2018年7月31日。记录患者总生存时间和无瘤生存时间。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 7.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用独立样本t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验；影响因素分析用Cox 比例风险模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌组织和癌旁组织中Rab3IP 的表达

Rab3IP 表达于细胞质，阳性蛋白被染成棕色或棕褐色颗粒。食管癌组织Rab3IP 高表达率为70.6%（77/109），癌旁组织为52.3%（57/109），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=7.747，P=0.005），癌组织高于癌旁组织。见图1。

图1 Rab3IP 在食管癌和癌旁组织中的表达 （免疫组织化学×200）

2.2 Rab3IP 在食管癌和癌旁组织中的表达

食管癌组织Rab3IP 相对表达量为（0.718±0.018），癌旁组织为（0.236±0.013），经独立样本t检验，差异有统计学意义（t=37.599，P=0.000），癌组织高于癌旁组织。见图2。

图2 Rab3IP 在食管癌和癌旁组织中的表达

2.3 两组患者不同因素的Rab3IP 阳性率比较

两组患者不同肿瘤直径、浸润深度、有无淋巴结转移及TNM 分期的Rab3IP 阳性率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 影响食管癌患者总生存时间的单因素和多因素分析

单因素和多因素分析显示，Rab3IP 表达是影响食管癌患者术后总生存时间的独立预后因素（P＜0.05）。Rab3IP 高表达组患者术后3年总生存率为42.1%，低表达组为70.6%，经Log rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=5.027，P=0.025），低表达组高于高表达组。见表2和图3A。

表1 两组患者不同因素的Rab3IP 阳性率比较例

2.5 影响食管癌患者无瘤生存时间的单因素和多因素分析

Rab3IP 表达是影响食管癌患者术后无瘤生存时间的独立预后因素（P＜0.05）。Rab3IP 高表达组患者术后3年无瘤生存率为39.5%，低表达组为67.5%，经Log rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=7.275，P=0.007），低表达组高于高表达组。见 表3和图3B。

表2 影响食管癌患者总生存时间的单因素和多因素分析参数

表3 影响食管癌患者无瘤生存时间的单因素和多因素分析参数

图3 食管癌患者Rab3IP 表达的生存曲线

3 讨论

Rab 蛋白属于GTPase 的Ras 超家族蛋白成员，主要通过胞吞和胞吐的方式参与囊泡的运输，与细胞器之间的胞内蛋白运输有关[7]。尽管Rab 蛋白的结构高度保守，其功能特异性高，但是当某些结构发生突变时，可导致蛋白运输错误，进而诱发某些疾病，如Rab27a 的双半胱氨酸异戊烯变成单半胱氨酸异戊烯时，使黑色素小体无法运输至高尔基体，导致格里塞利综合征[8]。Rab 结构突变不仅与基因遗传病有关，还参与肿瘤的发生和进展。有研究显示，结肠癌组织Rab25 蛋白呈显著高表达，敲低Rab11 表达可以抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭表型，Rab2A 可部分逆转miR-186-5p 诱导的乳腺癌细胞增殖能力减弱[9-10]。Rab3IP 是近年发现的Rab 蛋白家族新成员，其作为Rab 蛋白的主要激活蛋白，通过影响胞内运输过程和细胞骨架重构等参与多种疾病的发生[11]。

Rab3IP 与恶性肿瘤的发生有关，有研究表明，Rab3IP 可能通过调控上皮-间质转化过程参与肿瘤细胞的侵袭和转移，并介导肿瘤患者的不良预后[12]。HUR 等[13]发现Rab3IP 可被逆转录转座子LINE-1 激活，并参与结直肠癌的转移，Rab3IP 表达升高与结直肠癌的不良预后有关。本研究首次检测了食管癌组织Rab3IP 的表达，结果显示癌组织Rab3IP 表达明显高于癌旁组织，并且Rab3IP 高表达与肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期有关，提示高表达Rab3IP 可能使食管癌细胞侵袭和转移能力增强。目前对Rab 在肿瘤中的作用尚处于初步研究阶段，有学者认为Rab3IP 对囊泡转运的调控作用可能通过天然免疫调节影响肿瘤进程的多个环节[14]。此外Rab 蛋白促进了肿瘤细胞和基质细胞间的信号转导，为肿瘤细胞增殖和侵袭提供了有利的微环境[15]。

有研究证实，Rab3IP 与SSX2 结合是介导肿瘤不良生物学行为的关键环节[16]。有体外实验表明，SSX2通过ERα 信号通路调节Rab3IP 表达，使乳腺癌细胞发生上皮-间质转化，进而诱导细胞出现侵袭表 型[17]。REN 等[18]发现胃癌组织和细胞Rab3IP 表达显著上调，Rab3IP 高表达组术后5年总体生存率明显低于低表达组。本研究进一步分析了Rab3IP 表达与食管癌患者生存预后的关系，结果显示，Rab3IP 表达是影响食管癌患者总体和无瘤生存时间的独立预后危险因素，Rab3IP 高表达的食管癌患者术后总体生存时间和术后无瘤生存时间明显缩短，说明Rab3IP 的表达可以作为食管癌患者生存预后的评价指标。

综上所述，Rab3IP 在食管癌组织表达明显上调，Rab3IP 高表达患者总体和无瘤生存时间缩短，检测Rab3IP 表达有助于预测食管癌生存预后并指导临床治疗。但是本研究样本量偏少，且仅为单中心研究，Rab3IP 表达与食管癌患者的关系仍需要大样本证实。关于Rab3IP 发挥的肿瘤生物学效应的具体作用机制仍需要深入研究。