李清平，徐晶，蒋继贫

(1 荆门市第二人民医院，湖北荆门448000；2 华中科技大学同济医学院附属同济医院)

多发性骨髓瘤(MM)是一种克隆浆细胞异常增殖性恶性肿瘤，近年来其发病率逐年升高，已成为血液系统的第二大恶性肿瘤[1]。MM的发病机制尚不明确，目前仍被认为是不可治愈的疾病之一。多药耐药基因1(MDR1)定位于人7号染色体长臂，能够编码分子量为170 kD的细胞膜糖蛋白P-gp。P-gp是一种ATP依赖性跨膜转运蛋白，具有能量依赖性“药泵”功能，可将多种结构不同的化合物逆向转运出细胞。因此，MDR1及其编码蛋白P-gp介导的药物外排是肿瘤化疗多药耐药的重要机制[2，3]。白细胞分化抗原269(CD269)为B细胞表面分子，可与B细胞活化因子和增殖诱导配体(APRIL)结合，主要在体液免疫中发挥相应的生物学功能。有研究发现，CD269与APRIL结合可激活细胞内NF-κB信号通路，能够促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡[4]。近年研究还发现，CD269与APRIL结合激活细胞内NF-κB信号通路后，其下游转录因子能够促进MDR1表达[5]。因此，MDR1、CD269有可能参与MM的发生、发展，但目前国内外报道较少。为此，本研究观察了MM患者骨髓组织MDR1、CD269表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月～2018年6月荆门市第二人民医院收治的MM患者106例(观察组)。纳入标准：①符合2014年国际骨髓瘤工作组修订的MM诊断标准[6]，即骨髓单克隆浆细胞比例≥10%和(或)组织活检有浆细胞瘤，血清和(或)尿液出现单克隆M蛋白，伴或不伴靶器官损害；②初诊，入院前未接受任何抗肿瘤治疗；③一般身体状况良好；④临床病理资料完整。排除标准：①合并其他血液系统恶性肿瘤者；②合并其他器官恶性肿瘤、贫血性或免疫性疾病者；③合并心、肝、肺、肾等重要脏器严重功能障碍者；④妊娠期或哺乳期妇女；⑤临床病理资料不完整者。其中，男65例、女41例，年龄38～73(56.1±6.7)岁；细胞学类型：成熟浆细胞型16例，幼浆细胞型58例，原浆细胞型19例，网状细胞型13例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期73例，Ⅲ期33例；根据《中国多发性骨髓瘤诊治指南》[7]中的疗效和临床复发标准，规律治疗后完全缓解42例、部分缓解31例、疾病稳定33例，复发15例、未复发91例；随访截至2019年1月，随访时间1～60个月，中位随访时间36个月，以中位随访时间为界，生存时间<36个月10例、≥36个月96例。同期经骨髓穿刺证实骨髓功能正常的非血液系统疾病患者40例(对照组)，男21例、女19例，年龄38～68(57.0±6.8)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经荆门市第二人民医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 骨髓组织MDR1、CD269表达检测 采用RT-qPCR法。分别取两组骨髓组织2～4 mL，采用TRIzol法提取骨髓组织总RNA，经超微量分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.1，可用于后续实验。按照Fermentas逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按2×SYBR Green qPCR Msater Mix说明进行PCR扩增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：MDR1上游引物5′-CCAAAGTCAACAAGGAGTGC-3′，下游引物5′-TCTTCAACAGTGGTTTATCGCA-3′；CD269上游引物5′-ATGCAGCTGGCTTCA-3′，下游引物5′-TTCGTGAGTAAGGGG-3′；GAPDH上游引物5′-CCCCTTCATTGACCTCAACTACA-3′，下游引物5′-CGCTCCTGGAGGATGGTGAT-3′。PCR反应体系共20 μL：2×Tag PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，DEPC水7 μL；反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 45 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 两组骨髓组织MDR1、CD269表达比较 观察组与对照组骨髓组织MDR1相对表达量分别为11.16±1.32、0.32±0.09，CD269相对表达量分别为4.17±1.13、0.84±0.08。观察组骨髓组织MDR1、CD269相对表达量均明显高于对照组(t分别为33.854、18.580，P均<0.01)。

2.2 骨髓组织MDR1、CD269表达与MM患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 MM患者骨髓组织MDR1、CD269表达与临床病理特征的关系

2.3 MM患者骨髓组织MDR1表达与CD269表达的关系 Pearson相关分析显示，MM患者骨髓组织MDR1相对表达量与CD269相对表达量呈正相关关系(r=0.688，P<0.01)。

3 讨论

MM是一种克隆浆细胞异常增殖性恶性肿瘤，约占血液系统恶性肿瘤的10%[8]。随着我国人口老龄化加剧，MM的发病率有明显升高趋势。MM起病隐匿，临床表现复杂且缺乏特异性，极易漏诊和误诊。目前，MM尚不能治愈，其治疗缓解率较低、复发率较高且易产生耐药，预后较差。

MDR1定位于人7号染色体长臂，能够编码分子量为170 kD的细胞膜糖蛋白P-gp。P-gp是ATP结合盒转运蛋白超家族成员之一，能将多种结构不同的化合物逆向转运出细胞。因此，MDR1及其编码蛋白P-gp介导的药物外排是肿瘤化疗多药耐药的重要机制[2，3]。有研究发现，在血液系统肿瘤及实质器官肿瘤中MDR1异常高表达，并且其高表达与患者预后不良有关[9]。本研究结果发现，观察组骨髓组织MDR1相对表达量明显高于对照组，表明MDR1可能与MM的发生、发展有关。这可能与MM发生时HSE、NF-R2等反式作用因子及NF-κB/p65转录因子复合物均能调控MDR1启动子激活有关[10，11]。本研究结果还发现，骨髓组织MDR1相对表达量与MM临床分期和生存时间有关，而与性别、年龄、细胞学类型、是否复发无关，表明MDR1表达升高可能参与MM的恶性进展并导致患者预后不良。MDR1表达增加可促进细胞周期调节蛋白CNND1表达，进而促进肿瘤细胞持续增殖，这可能是导致MM恶性进展的重要机制之一[12]。

CD269又称B细胞成熟抗原，其基因定位于人染色体16p13，编码蛋白属于TNF受体超家族的成员。CD269仅表达在成熟B细胞表面，是一种重要的B细胞生物标志物，在B细胞发育和自身免疫应答中具有重要作用。CD269能够特异性结合肿瘤坏死因子配体超家族成员13b，并导致NF-κB和MAPK/JNK信号通路活化，从而促进细胞存活和增殖。研究表明，MM患者骨髓组织CD269表达明显升高，并可与APRIL结合激活下游相关信号通路，如NF-κB信号通路，促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为[13]。因此，CD269有可能参与MM的发生、发展。本研究结果发现，观察组骨髓组织CD269相对表达量明显高于对照组，表明CD269可能参与MM的发生、发展。当MM发生时，骨髓微环境中CD269的配体APRIL表达增加，可促进CD269表达及活化，进而通过激活下游靶基因，促进TGF-β、IL-10等表达；此外，CD269活化可激活JNK信号通路，进一步促进MM细胞增殖，而JNK信号通路激活反过来又促进CD269表达，从而形成正反馈回路[14]。本研究结果还发现，骨髓组织CD269相对表达量与MM临床分期和生存时间有关，而与性别、年龄、细胞学类型、是否复发无关，表明CD269表达增加可能促进MM的恶性进展并导致患者预后不良。有研究认为，CD269表达增加通过激活MAPK/AKT/NF-κB信号通路，通过上调CDC25B、ACK1等基因表达促进肿瘤细胞增殖，通过下调BIRC3、MCL1等基因表达抑制肿瘤细胞凋亡，通过上调VEGFR2、FGFR3等基因表达促进肿瘤血管生成，而用CD269单克隆抗体阻断其与APRIL结合，能够逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为[15]。

有研究发现，CD269与APRIL结合激活细胞内NF-κB信号通路后，其下游转录因子能够促进MDR1表达[5]，表明MDR1与CD269可能具有一定相关性。本研究结果显示，MM患者骨髓组织MDR1相对表达量与CD269相对表达量呈正相关关系，说明二者可能协同参与MM的发生、发展，与姜方毅等[16]报道一致。但MDR1与CD269相互作用的具体机制尚不清楚，仍需进一步研究。

综上所述，MM患者骨髓组织MDR1、CD269表达升高，二者可能协同参与MM的发生、发展。