张少娟，严莉，曲洪滨

(抚顺市中心医院，辽宁抚顺113006)

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，居女性恶性肿瘤的第二位[1]。近年来，宫颈癌的发病率逐年上升且呈年轻化趋势，已成为严重威胁中青年女性身体健康和生命安全的恶性疾病之一[2]。由于宫颈癌早期症状隐匿，缺乏特异性，多数患者确诊时已发展至中晚期，错过了最佳治疗时间，患者预后往往较差。目前，宫颈癌的发病机制尚不明确，临床缺乏敏感、特异的早期诊断方法和有效的治疗手段。因此，探索宫颈癌发病的分子机制，寻找肿瘤诊断的新型分子标志物和治疗靶标具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类内源性单链非编码小分子RNA，广泛参与体内细胞增殖、分化、凋亡等生命活动的调控。近年研究发现，miRNA可作为癌基因或抑癌基因，在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[2]。miR-135a-5p属于miR-135家族成员之一，已被证实可参与结直肠癌[3]、胶质瘤[4]等恶性肿瘤的发生、发展。GATA结合蛋白3(GATA3)属于Ⅳ型锌指蛋白GATA家族，是辅助性T细胞的特异性转录因子，对机体的免疫功能具有重要的调节作用。有研究发现，GATA3在尿道癌[5]、前列腺癌[6]等恶性肿瘤中发挥抑癌基因样作用。信号转导与转录激活因子3(STAT3)是信号转导与转录激活因子家族的重要成员，其异常激活可促进细胞恶性转化与进展。有研究发现，GATA3与STAT3之间具有一定调控作用[7]。但miR-135a-5p、GATA3、STAT3在宫颈癌发生、发展中的作用尚不清楚。本研究探讨了宫颈癌组织miR-135a-5p、GATA3、STAT3表达变化及其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年10月～2018年12月抚顺市中心医院收治的宫颈癌患者93例。所有患者经宫颈活检或术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合宫颈癌诊断；②初诊；③接受宫颈癌切除手术，术前未行任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②合并肝、肺、肾等重要脏器严重功能不全者；③合并严重感染性疾病者；④术前接受抗肿瘤治疗者；⑤临床病理资料不完整者。患者年龄29～71(45.2±5.1)岁，其中<50岁30例、≥50岁63例；肿瘤直径：≤3 cm 57例，>3 cm 36例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期71例，Ⅲ、Ⅳ期22例；浸润深度：≤1/2肌层58例，>1/2肌层35例；有淋巴结转移19例，无淋巴结转移74例。选择同期因子宫肌瘤、子宫内膜息肉等良性子宫疾病在抚顺市中心医院行宫颈活检或宫颈切除术患者93例，年龄25～69(45.9±4.6)岁。宫颈癌患者与良性子宫疾病患者年龄具有可比性。本研究经抚顺市中心医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 miR-135a-5p、GATA3、STAT3表达检测 采用real-time PCR法。手术切除或活检获取相应的宫颈组织(分别作为观察组和对照组)，采用TRIzol法提取组织总RNA，经超微量紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.1，可用于后续实验。按TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。逆转录反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min，反应产物置于-20 ℃冰箱保存备用。以cDNA为模板，按SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物序列由沈阳万类生物科技有限公司设计合成。引物序列：miR-135a-5p上游引物5′-TTGGTCTTGTTTCCCGGTCC-3′、下游引物5′-TCACAGCTCCACAGGCTAAC-3′，内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGA-3′；GATA3上游引物5′-ACACTCTGGAGGAGGAATGCCAAT-3′、下游引物5′-TTCGGTTTCTGGTCTGGATGCCTT-3′，STAT3上游引物5′-CTTCCGCCACTTGCCAATG-3′、下游引物5′-TGGATCTCCCCTACTCGGTG-3′，内参GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTTC-3′、下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反应体系共20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 2 μL，去离子水6 μL；反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、72 ℃ 35 s共35个循环。以U6或GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 两组miR-135a-5p、GATA3、STAT3表达比较 观察组与对照组miR-135a-5p相对表达量分别为6.37±1.51、1.08±0.16，GATA3相对表达量分别为0.35±0.12、1.13±0.15，STAT3相对表达量分别为5.01±1.33、0.98±0.19。观察组miR-135a-5p、STAT3相对表达量明显高于对照组，GATA3相对表达量明显低于对照组(t分别为33.597、39.158、28.927，P均<0.05)。

2.2 宫颈癌组织miR-135a-5p、GATA3、STAT3表达与患者临床病理特征的关系 宫颈癌组织miR-135a-5p表达与肿瘤临床分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者年龄、肿瘤直径、浸润深度无关(P均>0.05)；宫颈癌组织GATA3表达与肿瘤临床分期、浸润深度和淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者年龄、肿瘤直径无关(P均>0.05)；宫颈癌组织STAT3表达与肿瘤临床分期有关(P<0.05)，与患者年龄、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移无关(P均>0.05)。见表1。

表1 宫颈癌组织miR-135a-5p、GATA3、STAT3表达与患者临床病理特征的关系

2.3 宫颈癌组织miR-135a-5p、GATA3、STAT3表达的关系 Pearson相关分析显示，宫颈癌组织miR-135a-5p表达与GATA3表达呈负相关关系(r=-0.665，P<0.05)，与STAT3表达无明显相关性(r=0.267，P>0.05)；而宫颈癌组织GATA3表达与STAT3表达呈负相关关系(r=-0.453，P<0.05)。

3 讨论

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其早期症状隐匿，缺乏特异性，多数患者确诊时已发展至中晚期，错过了最佳治疗时机，患者预后往往较差。近年随着医疗技术的发展，涌现出了许多宫颈癌筛查新方法，同时宫颈癌疫苗广泛接种，在宫颈癌预防方面取得了较大进步。但对宫颈癌发病的分子机制仍不十分清楚，临床缺乏敏感、特异的早期诊断方法和有效的治疗手段。因此，探索宫颈癌发病的分子机制，寻找肿瘤诊断的新型分子标志物和治疗靶标具有重要意义。

miRNA是一类内源性单链非编码小分子RNA，由18～25个核苷酸组成，通过与靶基因mRNA序列特异性翻译抑制的相互作用，在转录后水平调节基因表达，从而广泛参与体内细胞增殖、分化、凋亡等生命活动的调控。近年研究发现，miRNA可作为癌基因或抑癌基因，在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[2]。目前已发现多种与宫颈癌发生、发展相关的miRNA，如miR-944高表达与宫颈癌患者预后不良有关[8]，miR-425-4p低表达能够抑制宫颈癌形成[9]。因此，miRNA有作为宫颈癌早期诊断的特异性分子标志物和治疗靶标的潜能。miR-135a-5p属于miR-135家族成员之一，已被证实可参与多种恶性肿瘤的发生、发展，如结直肠癌、胶质瘤等[3，4]。但目前miR-135a-5p在宫颈癌发生、发展中作用的报道较少。本研究结果显示，观察组miR-135a-5p相对表达量明显高于对照组，提示miR-135a-5p高表达有可能促进宫颈癌形成。本研究结果还发现，宫颈癌组织miR-135a-5p表达与肿瘤临床分期、淋巴结转移有关，与患者年龄、肿瘤直径、浸润深度无关，初步证实miR-135a-5p可能在宫颈癌恶性转化和淋巴结转移中具有重要调节作用。

GATA3属于Ⅳ型锌指蛋白GATA家族，是辅助性T细胞的特异性转录因子，对机体的免疫功能具有重要的调节作用。有研究发现，GATA3在尿路上皮、乳腺导管上皮分化过程中具有重要调节作用，具有作为乳腺癌、尿路上皮癌免疫学分子标志物的潜能[10]。本研究结果发现，观察组GATA3相对表达量明显低于对照组，表明GATA3可参与宫颈癌发生、发展。本研究结果发现，宫颈癌组织GATA3表达与肿瘤临床分期、浸润深度和淋巴结转移有关，与患者年龄、肿瘤直径无关，提示GATA3可参与宫颈癌侵袭、转移等恶性进展过程。生物信息学分析显示，GATA3可能是miR-135a-5p的靶基因[11]。因此，miR-135a-5p可能通过靶向调控GATA3表达，参与宫颈癌的发生、发展。本研究结果发现，宫颈癌组织miR-135a-5p表达与GATA3表达呈负相关关系，表明miR-135a-5p能够通过靶向调控GATA3表达，从而在宫颈癌中发挥促癌基因作用。

STAT3是信号转导与转录激活因子家族的重要成员，其基因定位于人染色体17q21.1，是一种原癌基因，能够促进肿瘤干细胞的自我更新和肿瘤侵袭、转移等[12]。STAT3在JAK-STAT信号通路活性的调节中发挥关键作用，其在正常细胞中处于低表达状态，而在肿瘤细胞中处于持续激活的高表达状态，其异常激活可促进细胞恶性转化与进展[13]。有研究发现，STAT3在宫颈癌组织中高表达，且其高表达与肿瘤组织低分化和淋巴结转移有关[14]。本研究结果发现，观察组STAT3相对表达量明显高于对照组，且其表达与肿瘤临床分期有关，表明STAT3在宫颈癌的发生、发展中具有促进作用，这可能与STAT3能够调控下游Survivin、VEGF表达，进而促进肿瘤细胞增殖有关[15，16]。进一步研究发现，宫颈癌组织GATA3表达与STAT3表达呈负相关关系。有研究发现，丙型肝炎病毒可增加miR-135a-5p表达，抑制其靶基因蛋白酪氨酸磷酸酶受体(PTPRD)表达，而PTPRD作为STAT3的负性调控因子，其低表达可促进STAT3表达，进而诱发肝细胞癌[17]。由此推测，宫颈癌组织miR-135a-5p高表达能够抑制GATA3活性，进而增强STAT3表达，而STAT3作用于下游信号分子，如Cyclin D1、IL-10、Survivin等，进而促进宫颈癌形成和恶性进展[18]。

综上所述，宫颈癌组织miR-135a-5p、STAT3高表达，GATA3低表达，三者可能协同促进宫颈癌形成和恶性进展。