李伟伟 闫娅妮 刘 聪 马 波 殷秀荣

(河北省秦皇岛市妇幼保健院1 生殖医学科，2 优生遗传科，秦皇岛市 066004，电子邮箱：woshifeng-531@163.com)

世界卫生组织报告，全球育龄人群中不孕不育的发病率高达10%～15%，其中男方因素占不孕不育所有病因的40%～50%[1]。近年来，特发性弱精子症引起的男性不育已成为临床男性科的疑难杂症，其发病机制成为研究的难题。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是最广泛的基因多态性，这些基因的不同可能会导致个体表型的差异、疾病的易感性等。目前，很多学者专注于男性不育与相关基因SNP相关性的研究，发现一些基因SNP可能参与细胞增殖和抗氧化过程，与精子发生过程相关，与男性不育存在一定的相关性[2-3]。精子阳离子通道(cation channel of sperm，CatSper)家族是精子特异性阳离子通道，共有4个成员(CatSper 1～4)[4]。CatSper1定位于鞭毛的主段，在增强精子运动、获能、超活化、受精等方面起重要作用，与弱精子症的发生相关[5-6]。本文旨在通过研究CatSper1的SNP与特发性弱精子症的相关性，进一步探索特发性弱精子症的发病机制，为治疗提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2016年5月至2018年6月在秦皇岛市妇幼保健院男科门诊就诊的192例特发性弱精子症患者作为弱精组。纳入标准：前向运动精子<32%；均正常性生活1年以上未育，其配偶无生殖相关疾病。另同期募集288例精液分析正常的已生育男性为对照组。所有研究对象均排除支原体、衣原体等感染，生殖激素和精浆生化检查均正常。弱精组年龄24～37(30.5±4.7)岁，体重(68.5±16.9)kg；对照组年龄25～36(29.8±6.1)岁，体重(71.3±23.8)kg。两组研究对象的年龄、体重差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经秦皇岛市妇幼保健院生殖伦理委员会讨论通过，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 精液的获取及常规分析 所有研究对象禁欲2～7 d，手淫法采集精液，收集于一次性无菌取精杯内，37℃水浴箱温育。待精液完全液化后按照世界卫生组织编写的《人类精液检查与处理实验室手册》第5版标准[7]，利用计算机辅助精子分析(computer-aided sperm analysis，CASA)系统进行常规分析，并进行精子形态学分析。

1.3 精液CatSper1 rs1893316位点的SNP检测

1.3.1 引物设计与合成：登录GenBank网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查询CatSper1基因全序列AF407333，引物设计采用Primer 5.0软件完成，由上海索宝生物科技有限公司合成。引物序列如下：CatSper1上游引物为5′-ATTTACAATGAAGGAGTTTGACACA-3,下游引物为5′-GCCAGAGGAATAGTGGGATAAA-3′;内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物为5′-GGTATCGTGGAAGGACTC-3′,下游引物为5′-GTAGAGGCAGGGATGATG -3′。

1.3.2 DNA的提取：将500 μL精液与500 μL生理盐水均匀混合后，4℃下10 000 r/min离心5 min，洗涤沉淀后待用。采用核酸提取试剂盒(上海之江生物科技，批号：P20181201)提取DNA，在沉淀中加入100 μL核酸提取液，震荡混匀，置于100℃水浴中10 min。4℃下10 000 r/min离心10 min后洗涤沉淀，-20℃保存备用。

1.3.3 SNP的检测：将所有标本的DNA送至上海生物工程公司进行飞行时间质谱分析，采用Sequenom公司的MassArray生物芯片系统进行操作。(1)PCR扩增；(2)单碱基延伸；(3)树脂纯化；(4)芯片点样，启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom公司)芯片上；(5)质谱检测，将点样后的SpectroCHIP芯片使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(Sequenom公司)分型并输出结果。

1.4 精液CatSper1 mRNA的检测

1.4.1 标本处理：将液化后的精液缓慢加入密度梯度液上层，800 r/min离心15 min后洗涤沉淀，弃去上清，将沉淀混匀后轻轻加入装有0.5 mL培养液的试管底部置培养箱，将试管倾斜45°，静置30 min，收集上层云雾状精液用于mRNA及蛋白的检测。

1.4.2 mRNA的检测：利用Trizol试剂(Invitrogen公司，批号：10296010)提取总RNA。适量的焦碳酸二乙酯水溶解RNA沉淀，-70℃保存备用。取适量总RNA稀释后用分光光度计测定A260/A280，比值均在1.8～2.0，计算浓度后备用。使用反转录反应试剂盒(Fermantas公司，批号：K1622)进行反转录，操作严格按照说明书进行，产物于-70℃保存待用。建立25 μL PCR体系，包括2×Taq酶PCR反应混合液12.5 μL，20 μmol/L上下游引物各1.5 μL，模板DNA 2.0 μL，重蒸馏水7.5 μL。PCR反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min，降至4℃保温。扩增片段长度为261 bp，凝胶电泳观察结果。使用Quantity-One软件进行分析，以目的基因与内参基因GAPDH灰度比值表示目的基因的mRNA相对表达量。

1.5 精液CatSper1蛋白的检测 将精液标本在室温下液化30 min，4℃下2 400 r/min离心15 min将精子与精浆分离，弃去上清液并用PBS洗涤3次。将沉淀重新悬浮，调节至含有50×106个精子/mL，置于1.5 mL离心管内，在4℃的CHAPS缓冲液{20 mmol/L Hepes(pH 7.4)、140 mmol/L氯化钠、10 mmol/L 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基]丙磺酸内盐、2 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L乙二醇双四乙酸和完全蛋白酶抑制剂混合物}中匀浆，并在4℃下在热振荡器上孵育30 min。然后将裂解物进行15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(德国Roche Biosciences公司)上。将膜用5%脱脂奶粉在Tris缓冲盐水[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)及150 mmol/L氯化钠]中室温封闭4 h后与Tris缓冲盐水稀释的鼠抗Catsper1抗体(1 ∶500；Abcam公司,批号：ab165120)室温孵育过夜，用含有0.1%吐温20的Tris缓冲盐水洗涤3次后，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠的IgG(1 ∶4 000；Abcam公司,批号：ab150077)室温孵育1 h。显影仪快速显影后用Image软件对图像进行分析。

1.6 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。采用拟合优度χ2检验对各组基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验；采用单因素Logistic回归模型进行危险因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组精液常规分析结果比较 弱精组的前向运动精子比例低于对照组(P<0.05)，而两组的精液浓度及体积、精子正常形态率差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 两组精液常规分析结果比较(x±s)

2.2 两组CatSper1基因rs1893316位点基因型和基因频率、遗传模型比较 CatSper1基因rs1893316位点的基因型在对照组及弱精组的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(均P>0.05)，见表2。两组的CatSper1基因rs1893316位点基因型及等位基因的分布频率比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中弱精组TT基因型、CT基因型及T等位基因高于对照组(P<0.05)。见表3。

表2 CatSper1基因rs1893316位点基因型的Hardy-Weinberg平衡检验结果[n(%)]

表3 两组CatSper1基因rs1893316位点基因型及等位基因分布的比较[n(%)]

2.3 CatSper1基因rs1893316位点多态性与特发性弱精子症的相关性 为了便于分析，将基因型多态性合并为二分类变量，产生遗传学显性模型、隐性模型和等位基因三种二分类结果。弱精组中，显性模型CC/(CT+TT)为92/100例，隐形模型TT/(CT+TT)为21/171例；对照组中，显性模型CC/(CT+TT)为183/105例，隐形模型TT/(CT+TT)为16/272例。以显性模型、隐性模型和等位基因为自变量(均设置哑变量)，弱精症的发生作为因变量，进行单因素Logistic回归分析。结果显示，携带CatSper1基因rs1893316位点野生型CC是弱精症发病的保护因素，而携带突变型TT和等位基因T是弱精症发病的危险因素(均P<0.05)。见表4。

表4 CatSper1基因rs1893316位点多态性和弱精症发病风险的相关性分析

2.4 两组不同基因型携带者CatSper1 mRNA和蛋白的表达比较 携带TT基因型者中，弱精组的CatSper1 mRNA和蛋白相对表达水平均低于对照组(均P<0.05)。对于携带CC和CT基因型者，由于样本量很大，我们在对照组和弱精组中均随机各选取20例进行检测，结果显示CatSper1 mRNA和蛋白相对表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表5及图1。

表5 两组不同基因型携带者CatSper1 mRNA和蛋白相对表达水平比较(x±s)

图1 携带不同基因型者精液CatSper1蛋白的表达情况

3 讨 论

近期有研究表明，精子鞭毛段和顶体主要含有一种特殊的蛋白质家族，称为CatSpers，其可以介导钙离子的流动，从而调节精子活力和过度活跃，在顶体反应和获能中起重要作用[8]。有学者发现。CatSper1敲除的小鼠精子活力较差，精子缺乏快速的前向线性运动以及环磷酸腺苷诱导的钙离子内流，并且鞭状运动减弱[9]，提示Catsper1与精子活力密切相关。CatSper1敲除后精子不仅在获能后仍未见鞭状运动，也失去了穿透透明带的能力，精子尾部的钙离子内流消失[10]，这表明Catsper不仅可以调节精子运动，还可以在精子过度活跃和顶体反应中发挥作用[11-12]。此外，临床研究表明，某些特发性不育症患者的精子活力下降与突变引起的Catsper1异常表达有关[13]。Wang等[14]研究发现CatSper1在附睾精子中下调或促进弱精子症的发生，而生精散治疗能够诱导弱精症模型大鼠的CatSper1上调和精子活力的提高。

近年来，已经有关于基因SNP与特发性弱精子症相关性的研究报道。例如，Buldreghini等[15]报告，编码内皮型一氧化氮合成酶中天冬氨酸(Glu298Asp)的T等位基因可能导致精子活力变弱。然而，很少研究关注CatSper 的SNP与特发性弱精子症之间的关系。虽然Visser等[16]报告了相关调查结果，他们只提供了序列数据，并没有对较大样本进行相关分析。因此，我们在Visser等的研究基础上，使用Sequenom的生物芯片系统，对192例特发性弱精子症和288例健康者精液CatSper1基因rs1893316位点的SNP进行检测。结果显示，弱精组TT基因型、CT基因型及T等位基因频率高于对照组(P<0.05)；Logistic回归分析显示野生型CC是弱精症发病的保护因素，而突变型TT和等位基因T是特发性弱精症发病的危险因素(均P<0.05)。这提示CatSper1基因rs1893316位点的SNP与弱精子症的发生相关，可能是决定特发性弱精子症遗传易感性的重要因素，其中携带突变型TT和等位基因T者发生特发性弱精子症的风险更高。

作为同义SNP，rs1893316不改变CatSper1蛋白质结构。因此，我们推测rs1893316不通过影响氨基酸结构导致特发性弱精子症的发生。然而，位于CatSper1基因的第一个外显子中的rs1893316可能通过影响转录而导致特发性弱精子症。因此，我们评估了CatSper1基因rs1893316位点的SNP与CatSper1 mRNA和蛋白表达的关系，结果显示弱精组携带TT基因型患者的CatSper1 mRNA和蛋白表达水平均低于对照组携带TT基因型者(均P<0.05)；然而，对照组和弱精组之间携带CC或CT基因型者的CatSper1 mRNA和蛋白的表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)。这提示CatSper1 mRNA和蛋白表达下调，可能导致携带CatSper1基因rs1893316位点TT基因型者更易发生特发性弱精子症。

综上所述，CatSper1基因的rs1893316多态性位点与特发性弱精子症相关，携带TT基因型者发生特发性弱精子症的风险增加，这可能与CatSper1表达下调有关。