王一唯 黄 婷 孙 笑 王玉东

(上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院，上海200030)

子宫内膜癌是最常见的女性生殖恶性肿瘤之一，占妇科恶性肿瘤的20%～30%[1]。在2015年，中国约有63 400例子宫内膜癌新发病例和21800例死亡病例[2]。子宫内膜癌进展是一个多因素调控的复杂过程。我们前期研究发现，核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)作用于其受体RANK后能促进子宫内膜癌上皮间质转化过程，并促使组织蛋白酶S(Cathepsin S，CTSS)高表达[3]。有报道发现免疫细胞在子宫内膜癌的进展过程中发挥了重要作用[4]，且CTSS能在膀胱癌等多种癌症中通过AKT信号途径募集调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)干扰肿瘤的侵袭过程[5]。浸润于肿瘤的Treg细胞主要通过细胞间直接接触(Cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4)和分泌抑制性细胞因子(IL-10和TGF-β)这两种方式来发挥其免疫抑制功能[6]。但Treg细胞参与调控子宫内膜癌进展的研究少有报道。因此，本课题尝试研究子宫内膜癌中RANKL与Treg细胞之间的调控关系，从而为子宫内膜癌的免疫治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 研究共纳入2013年至2019年本院经手术后病理证实的44例子宫内膜癌患者。子宫内膜癌按照FIGO(The International Federation of Gynecology and Obstetrics)分期标准Ⅰ期31例，Ⅱ期7例[7]。其中，石蜡标本来自于2013年至2017年的32例子宫内膜癌患者。血清标本来自于2017年至2019年的12例内膜癌患者。同期纳入15例因子宫肌瘤行子宫切除的正常内膜组织和8例正常人的血清样本作为对照组。样本收集经过上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院科研伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

1.1.2实验材料 主要试剂包括Hec-1B细胞(中科院细胞库)，外周单个核细胞(美国ALLCELLS公司)，RANK慢病毒(上海和元生物科技公司)，重组人TGF-β，重组人RANKL(美国Peprotech公司)，人RANKL ELISA试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司),人CTSS 酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)，CTSS(台湾Genetex公司)，RANKL、Foxp3、GAPDH抗体(美国Abcam公司)，p-AKT、AKT、p-mTORC、mTORC抗体(美国CST公司)，LEAFTM-purified anti-human CD3(OKT3)、LEAFTM-purified anti-human CD28 (CD28.2)、重组人TGF-β、FITC标记的CD4抗体、PE标记的CD25抗体(美国eBioscience公司)，SDS-PAGE试剂(上海生工生物工程股份有限公司)，DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，青链霉素(美国Sigma公司)，人初始CD4+分选盒(美国Stemcell公司)。主要设备包括流式细胞仪(BD公司)，Bio-Rad电泳仪，Bio-Rad Western blot化学发光成像系统，分光光度仪(Beckman公司)，倒置显微镜(Leica公司)。

1.2方法

1.2.1免疫组化染色 将子宫内膜癌及正常内膜组织的石蜡切片常规脱蜡至水，枸橼酸缓冲液高压锅抗原热修复，用10%牛血清封闭，分别加入RANKL抗体(1∶200)、CTSS抗体(1∶200)和GAPDH抗体(1∶400)后4℃过夜。加相应二抗(1∶1 000)37℃孵育60 min。DAB显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。每张切片40倍镜随机选取5个视野观察，计数着色阳性的细胞百分比，结果取平均值。对组织切片的评价采用半定量的H评分(H-score)分析[8]。H评分=阳性细胞百分比×着色强度分级。无着色为0分，出现较浅的阳性染色为1分，出现中等的阳性染色为2分，出现强阳性染色为3分。

1.2.2Treg细胞分离和培养 取人外周血单个核细胞，加入初始CD4+分选抗体孵育5 min，加入磁珠孵育5 min。样品管置于磁铁上分选。取上清，离心1 000 r/min，5 min。将细胞铺于CD3抗体(1 mg/ml)和CD28抗体(1 mg/ml)包被的24孔板上，加入TGF-β(5 μg/L)刺激，于培养箱培养5 d。取出离心后于1×106细胞中分别加入FITC标记的CD4抗体(1∶400)和PE标记的CD25抗体(1∶400)染色30 min。每个样品设置同型对照。样品管至于流式细胞仪上检测。

1.2.3慢病毒干扰实验 慢病毒载体为pLKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA。肿瘤细胞培养至70%密度时，加入慢病毒和polybrene试剂(5 μg/L)培养。12 h后观察细胞状态，更换培养基并使用嘌呤霉素筛选2周。

1.2.4酶联免疫吸附实验 将患者和对照组外周血血清和标准品稀释后加入包被RANKL抗体的96孔板，固定，37℃孵育60 min，加二抗孵育60 min。加入显色剂显色，酶标仪上读取A405 吸收值。

1.2.5Western blot 将RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂)加入经过外源性RANKL刺激(1 μg/ml)和对照处理的Hec-1B细胞组，提取总蛋白，测定蛋白浓度。配置10%的下层胶和5%的浓缩胶，上样蛋白进行SDS-PAGE，转至NC膜。经5%牛血清蛋白封闭后，分别加入CTSS(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、p-mTORC(1∶1 000)抗体后4℃过夜。加相应二抗(1∶10 000)37℃孵育60 min。加入ECL显色剂显色。

1.2.6Transwell实验 将一定量的Hec-1B细胞或者Treg细胞消化离心，计数，均匀接种至Transwell上室底部，再将小室放入加了Treg细胞培养液(Hec-1B侵袭)和Hec-1BshRANK及对照组(Treg细胞趋化)的24孔板中培养。培养Hec-1B细胞24 h(Treg细胞6 h)后，取出小室，PBS清洗3次，用多聚甲醛对小室底部背面穿过的细胞进行固定。使用结晶紫对其进行染色，镜检计数(免疫细胞离心并计数)并分析作图。

1.3统计学处理 所有数据采用SPSS22.0和Graphpad Prism 7.0进行分析和作图，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1患者的血清及组织中RANKL和CTSS表达水平分析 免疫组化的结果提示，子宫内膜癌患者肿瘤组织中的RANK和CTSS表达水平均高于对照组(P<0.001)，见图1A、B。如图1C示，ELISA结果显示，子宫内膜癌患者的血清RANKL水平(62.45 ± 5.18)pg/ml高于对照组(9.667±1.202)pg/ml，P=0.002。

2.2患者的血清及组织Treg细胞数量分析 免疫组化的结果显示，如图2A所示，子宫内膜癌患者组织中浸润的Treg细胞明显多于正常组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术的结果提示，子宫内膜癌患者外周血中Treg细胞比例(8.94±0.97)%高于对照组(6.15±1.26)%，P<0.05，见图2B。

2.3RANKL对CTSS表达的调控作用 Western blot结果显示，加入外源性RANKL(1 μg/ml)能上调Hec-1B中的CTSS蛋白水平(P<0.05)，见图3A、B。同时，将干扰RANK表达的Hec-1B与Treg细胞共培养后发现，与对照组相比，Hec-1BshRANK能明显抑制CTSS引起的Treg细胞浸润(P<0.01)，见图3C。

2.4Treg细胞浸润对子宫内膜癌侵袭的影响 从图4可见，Transwell实验的结果显示，加入Treg细胞培养上清后小室下室的Hec-1B细胞数明显增加，实验组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5RANKL对AKT/mTORC信号通路的影响 Western blot结果显示，给予外源性RANKL后，AKT和mTORC的磷酸化水平相较于对照组明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图1 血清及组织RANKL和CTSS的表达Fig.1 Expression of RANKL and CTSS in serum and tissueNote: A.Expression of RANKL and CTSS in endometrium; B.Bar charts of RANKL and CTSS；C.Expression of RANKL in serum.Scale bars=50 μm.**.P<0.01.

图2 血清及组织Treg细胞的表达Fig.2 Expression of Tregs in serum and tissueNote: A.Expression of Foxp3 in endometrium; B.Amount of Treg in serum.*.P<0.05.

图3 RANKL对CTSS的表达调控及其募集Treg细胞能力Fig.3 Effects of RANKL on modulating CTSS and recruiting TregsNote: A.Expression of CTSS and GAPDH after stimulating with RANKL; B.Bar charts of CTSS; C.Amount of Tregs after interfering RANK.*.P<0.05.**.P<0.01.

图4 Treg细胞对子宫内膜癌侵袭能力的影响Fig.4 Effect of Treg on capacity of invasionNote: A.Amount of Hec-1B after culturing with Treg supernatant; B.Bar charts of Hec-1B.**.P<0.01.Scale bars.50 μm.

图5 RANKL对p-AKT及p-mTORC的表达调控Fig.5 Effects of RANKL on modulation of p-AKT and p-mTORCNote: A.Expression of p-AKT and p-mTORC after stimulating RANKL; B.Bar charts of p-AKT and p-mTORC.*.P<0.05;**.P<0.01.

3 讨论

本次研究的目的是分析子宫内膜癌患者肿瘤组织中RANKL的表达水平，并探讨其对子宫内膜癌侵袭功能的影响。RANKL基因位于13号染色体上，属Ⅱ型跨膜蛋白,在体内以膜结合型和可溶性羧基末端两种形式存在[9]。最近的研究发现，RANKL动员多种免疫细胞，参与一些自身免疫疾病的进展[10,11]。在乳腺癌中，RANKL能在孕激素的调控下影响AKT/mTORC通路，从而介导肿瘤细胞的转移[12,13]。我们之前的研究已经证实，内膜癌细胞株受到RANKL刺激后能上调N-cadherin和下调E-cadherin的表达从而促进子宫内膜癌转移[4]。本研究结果显示子宫内膜癌患者血清和肿瘤组织中的RANKL蛋白水平均显著高于对照者。同时，共培养实验证明，RANKL能促进Treg细胞的聚集，从而增强了子宫内膜癌的侵袭能力，提示RANKL在子宫内膜癌进展过程中起着重要作用。

之前的研究认为RANKL能促进巨噬细胞向Ⅱ型(免疫抑制型)转化，从而促进肿瘤局部形成免疫抑制状态。这也与本次研究的结果相符。我们发现，子宫内膜癌患者中肿瘤组织CTSS表达水平高于对照组。干扰RANK表达能明显抑制CTSS的蛋白水平，并且能抑制Treg细胞的聚集。CTSS是一种半胱氨酸蛋白酶，具有肽链内切酶活性[14]。研究表明，CTSS可影响免疫细胞MHCⅡ抗原呈递，并且能水解抗原表位造成免疫逃逸[15]。这些结果提示了CTSS在RANKL募集Treg细胞促进子宫内膜癌迁移中可能发挥了重要作用。

综上所述，本次研究发现，RANKL募集Treg细胞之后可增强子宫内膜癌的侵袭功能。其作用机制可能是通过促进AKT和mTORC的磷酸化，影响CTSS的表达。本研究初步探讨了子宫内膜癌中Treg细胞的影响，将为子宫内膜癌的诊断和治疗提供了潜在靶点。