王小清 王金莲 林 帅 侯令密 谢少利 青 晓

(川北医学院附属医院甲状腺乳腺外科，南充637000)

乳头状甲状腺癌(Papillary thyroid cancer,PTC)在所有甲状腺肿瘤中最为常见，所占比例大约85%～90%[1]，该肿瘤疾病目前的主要治疗方法是手术切除，具有较高的术后治愈率和生存率，然而对甲状腺癌的手术治疗会损害患者甲状腺功能，导致钙代谢紊乱、喉神经损伤等疾病发生[2]，严重影响了患者的生活质量。因此，寻找副作用低的可替代疗法对于改善PTC患者治疗后的生活质量具有重要意义。

基质金属蛋白酶家族(Matrix metalloproteinase,MMP)在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥着重要作用[3]。其中MMP14定位于质膜，参与了组织生长发育和血管生成等生理过程[4,5]，该酶可激活MMP2蛋白表达，从而提高肿瘤细胞的侵袭能力[6]。研究表明MMP14参与了多种肿瘤细胞的生长与扩散过程，证实了MMP14表达与甲状腺癌的发生发展的相关性，因此，MMP14具有作为临床上癌症诊断检测指标以及基因靶向治疗位点的潜力[7-10]。

MicroRNA(miRNA)是一类长度约22 nt的小分子非编码RNA，可通过与mRNA 3′UTR结合沉默目的基因，在癌症中发挥着重要的调控作用[11]。miR-369-3p已被报道在PTC中可以抑制肿瘤细胞增殖[12]。通过生物信息学预测，MMP14很可能是miR-369-3p的作用靶点之一，本研究通过培养人乳头状甲状腺癌B-CPAP细胞，并通过miR-369-3p mimic处理及构建MMP14过表达细胞株，初步探究了miR-369-3p在PTC细胞中与MMP14的相互作用及调控机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 RPMI1640细胞培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司，Trizol试剂、RIPA裂解液、BCA试剂盒、Ecl显色液购自北京索莱宝生物公司，反转录试剂盒和SsoFastTMEva-Green®Supermix试剂盒购自美国Bio-rad公司，Taqman miRNA RT 试剂盒、Taqman universal master mix试剂盒购自美国Applied Biosystems公司，双荧光素酶报告检测系统购自美国Promega公司，MMP14、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)、N-钙黏着蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Twist、上皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-extracellular regulated protein kinases1/2,p-ERK1/2)、细胞外调节蛋白激酶1/2(Extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、MMP2、GAPDH抗体购自Abcam公司，重组慢病毒颗粒、miR-369-3p mimic和阴性对照mimic均由受上海汉恒生物科技公司合成，实验用到的引物采用Primer3 Input网站设计，由华大基因合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人乳头状甲状腺癌细胞株B-CPAP购自ATCC公司，采用含有10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI1640细胞培养液，5%CO237℃培养箱培养，2～3 d换一次液。

1.2.2细胞分组及处理方法 将B-CPAP细胞分为B-CPAP组、mimic-NC组、miR-369-3p mimic组、pLV-MMP14组、mimic+pLV-MMP14组，其中B-CPAP组作为空白对照，mimic-NC组和miR-369-3p mimic组按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书，分别转染阴性对照mimic(mimic-NC)和miR-369-3p mimic。MMP14重组慢病毒颗粒感染pLV-MMP14组和mimic+pLV-MMP14组细胞，其中mimic+pLV-MMP14组进一步转染miR-369-3p。转染进行48 h后用于后续检测。

1.2.3病毒感染B-CPAP细胞 处于对数生长期的B-CPAP细胞接种于6孔板，每孔细胞数约5×104个，待细胞生长至铺满板底70%空间时，使用含1×108TU/ml MMP14重组慢病毒颗粒病毒液感染B-CPAP细胞，每孔10 μl。24 h后换成新鲜完全培养液37℃继续培养，感染后48 h，加入终浓度2 μg/ml的Puromycin，2～3 d换一次液。

1.2.4RT-PCR检测mRNA表达水平 根据1.2.2所述的方法分组和处理细胞后，Trizol提取各组细胞RNA，反转录合成cDNA后进行PCR反应，循环条件：预变性95℃ 10 min，变性95℃ 15 s，退火60℃ 1 min，循环次数40次。SsoFastTMEva-Green®Supermix试剂盒检测mRNA水平，2-ΔΔCt法进行计算。

1.2.5荧光素酶报告实验检测 通过生物信息学数据库Targetscan预测miR-369-3p和MMP14基因的靶向作用关系，分别构建MMP14 Lenti-reporter-luciferase野生型和突变型载体，将细胞分为MMP14 WT、MMP14 WT+miR-369-3p mimic、MMP14 MUT、MMP14 MUT+miR-369-3p mimic四组，24孔板放置1 d，野生型和pRL-CMV载体共转染MMP14 WT和MMP14 WT+miR-369-3p mimic组，突变型载体和pRL-CMV载体共转染MMP14 MUT和MMP14 MUT+miR-369-3p组，miR-369-3p mimic分别转染MMP14 WT+miR-369-3p mimic和MMP14 MUT+miR-369-3p mimic组，转染48 h后使用荧光素酶报告检测系统检测荧光素酶活性。

1.2.6Transwell法检测细胞侵袭 50 μl 基质胶加入Transwell小室中，37℃凝固3 h，上室和下室分别加入无血清培养基和完全培养基，按1.2.2所述的方法分组和处理细胞后，接种于Transwell小室上室，培养48 h后取出小室并擦除未通过膜的细胞，剩下的细胞使用多聚甲醛固定，1% 结晶紫染色拍照。

1.2.7划痕法检测细胞迁移 按1.2.2所述的方法分组和处理细胞后，接种于6孔板，细胞长满80%时使用中等枪头垂直水平划线，PBS反复清洗3次，5%CO237℃培养箱中培养，24 h后取出拍照。

1.2.8Western blot检测蛋白表达水平 按1.2.2所述方法分组和处理细胞，RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA定量，每组取30 μg蛋白通过SDS-PAGE (10%)进行分离，半干转膜法转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗4℃孵育过夜。TBST反复冲洗3次，加入二抗孵育2 h，二抗孵育完毕，通过TBST清洗三次，ECL显色液显影，GAPDH为内参。

2 结果

2.1miR-369-3p抑制PTC细胞MMP14的基因表达 如图1A所示，与B-CPAP组比较，miR-369-3p mimic组miR-369-3p表达水平显著升高(P<0.01)，差异具有统计学意义，mimic-NC组miR-369-3p表达水平无显著差异，表明miR-369-3p成功转染了B-CPAP细胞；同时，miR-369-3p mimic组中MMP14 mRNA表达水平显著降低(P<0.01)，差异有统计学意义，mimic-NC组MMP14 mRNA表达水平无显著差异，见图1B。结果表明miR-369-3p和MMP14的基因表达存在相互关联。

2.2miR-369-3p靶向作用于MMP14基因抑制其蛋白表达 如图2A所示，与MMP14 WT组比较，MMP14 WT+miR-369-3p mimic组荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，差异有统计学意义；MMP14 MUT组与MMP14MUT+miR-369-3p mimic组均无显著差异。同时，与B-CPAP比较，miR-369-3p组MMP14蛋白表达水平显著降低，pLV-MMP14组MMP14蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与pLV-MMP14组比较， mimic+pLV-MMP14组MMP14蛋白表达水平显著降低，但仍高于miR-369-3p mimic组(P<0.01)，差异有统计学意义。结果表明miR-369-3p可通过靶向作用于MMP14基因，抑制MMP14的蛋白表达。

图1 miR-369-3p对B-CPAP细胞MMP14基因表达水平的影响Fig.1 Effects of miR-369-3p on gene expression level of MMP14 in B-CPAP cellNote: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group.

图2 荧光素酶报告实验检测miR-369-3p与MMP14的靶向作用Fig.2 Luciferase reporter assay was performed for measuring targeting relationship between miR-369-3p and MMP14Note: n=6,**.P<0.01 versus MMP14 WT or miR-369-3p mimic group;##.P<0.01 versus miR-369-3p and pLV-MMP14 group.

2.3miR-369-3p靶向作用于MMP14抑制PTC细胞的侵袭能力 如图3所示，与B-CPAP组比较，miR-369-3p mimic组侵袭细胞数量显著降低，pLV-MMP14组侵袭细胞数量显著升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与pLV-MMP14组比较，mimic+pLV-MMP14组侵袭细胞数量显著降低，但仍高于miR-369-3p mimic组(P<0.01)，差异有统计学意义。结果表明，miR-369-3p对MMP14的靶向作用可抑制PTC细胞的侵袭能力。

2.4miR-369-3p靶向作用于MMP14抑制PTC细胞的迁移能力 如图4所示，与B-CPAP组比较，miR-369-3p mimic组划痕愈合率显著降低，pLV-MMP14组划痕愈合率显著升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与pLV-MMP14组比较，mimic+pLV-MMP14组划痕愈合率显著降低，但仍高于miR-369-3p mimic组(P<0.01)，差异有统计学意义。结果表明，miR-369-3p对MMP14的靶向作用可抑制PTC细胞的迁移能力。

2.5miR-369-3p靶向作用于MMP14调控EMT相关蛋白的表达 如图5所示，与B-CPAP组比较，miR-369-3p mimic组E-cadherin蛋白表达水平显著升高，N-cadherin、Vimentin、Twist蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，pLV-MMP14组E-cadherin蛋白表达水平显著降低，N-cadherin、Vimentin、Twist蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与pLV-MMP14组比较，mimic+pLV-MMP14组E-cadherin蛋白表达水平显著升高，但仍低于miR-369-3p mimic组(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin、Twist蛋白表达水平显著降低，但仍高于miR-369-3p mimic组(P<0.01)，差异有统计学意义。结果表明miR-369-3p靶向作用于MMP14，可降低PTC细胞EMT水平。

图3 MMP14和miR-369-3p对B-CPAP细胞侵袭能力的影响(×400)Fig.3 Effects of MMP14 and miR-369-3p on invasion ability of B-CPAP cell(×400)Note: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group;##.P<0.01 versus miR-369-3p mimic and pLV-MMP14 group.

2.6miR-369-3p靶向作用于MMP14调控EGFR-ERK信号通路相关蛋白表达 如图6所示，与B-CPAP组比较，miR-369-3p mimic组EGFR、p-ERK1/2、VEGF、MMP2蛋白表达水平显著降低，pLV-MMP14组EGFR、p-ERK1/2、VEGF、MMP2蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与pLV-MMP14组比较，mimic+pLV-MMP14组EGFR、p-ERK1/2、VEGF、MMP2蛋白表达水平显著降低，但仍高于miR-369-3p mimic组(P<0.01)，差异有统计学意义。结果表明miR-369-3p靶向作用于MMP14，对PTC细胞侵袭和迁移的调控机制可能与EGFR-ERK信号通路有关。

图4 MMP14和miR-369-3p对B-CPAP细胞迁移能力的影响(×200)Fig.4 Effects of MMP14 and miR-369-3p on migration ability of B-CPAP cell(×200)Note: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group;##.P<0.01 versus miR-369-3p mimic and pLV-MMP14 group.

图5 MMP14和miR-369-3p对EMT相关蛋白表达的影响Fig.5 Effects of MMP14 and miR-369-3p on EMT related protein expressionNote: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group;##.P<0.01 versus miR-369-3p mimic and pLV-MMP14 group.

图6 MMP14和miR-369-3p对EGFR-ERK信号通路表达的影响Fig.6 Effects of MMP14 and miR-369-3p on EGFR-ERK signal pathway related protein expressionNote: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group;##.P<0.01 versus miR-369-3p mimic and pLV-MMP14 group.

3 讨论

癌症是危害人类健康的最严重疾病之一，其最重要的生物学特征之一是侵袭和转移能力，是癌症引起患者死亡及术后复发的主要原因。MMP家族蛋白酶在肿瘤细胞的侵袭和转移中扮演着重要的角色，该家族成员主要通过破坏细胞外基质，促使肿瘤细胞能够入侵到周围组织当中[13]。MMP14是MMP家族的成员之一，是一种定位于质膜的MMP蛋白酶，研究表明该酶在多种癌症中都发挥了重要的作用，因此，MMP14具有作为新的靶向治疗位点的潜力。

本实验室前期研究通过生物信息学预测，发现miR-369-3p可能与MMP14存在靶向作用关系，MMP14在肿瘤细胞的侵袭和迁移过程中发挥着关键作用。当MMP14经过反式高尔基体网络运输到细胞表面后，可促进诸如MMP2等前体的激活，进而增强了细胞外基质的降解，促进癌细胞的侵袭作用；同时MMP14还可与细胞表面跨膜糖蛋白CD44结合，参与了细胞伪足的形成，与癌细胞的运动过程有关[14]。本研究推测miR-369-3p可能通过作用于MMP14，进而抑制PTC细胞的侵袭和迁移。为了验证这一推测，本文首先检测了miR-369-3p mimic处理下B-CPAP细胞的MMP14基因和蛋白表达水平，研究发现miR-369-3p显著降低了MMP14的基因和蛋白表达水平。进一步本文通过荧光素酶报告检测了miR-369-3p和MMP14的靶向作用关系，发现miR-369-3p与MMP14存在靶向作用关系，表明miR-369-3p在PTC细胞中可靶向作用于MMP14基因，抑制MMP14基因的表达。为了探究miR-369-3p靶向作用MMP14基因对PTC细胞侵袭和迁移的影响，本文对细胞侵袭和迁移能力进行了检测，发现miR-369-3p显著抑制了B-CPAP细胞的侵袭和迁移能力，而MMP14的过表达可逆转miR-369-3p的这一作用。以上实验结果表明，miR-369-3p可通过靶向作用于MMP14，抑制PTC细胞的侵袭和迁移。

在肿瘤细胞的侵袭和迁移中，上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)发挥着关键作用，通过EMT，肿瘤细胞失去自身的上皮分化特性，包括细胞黏附和极性，并获得了间叶细胞的特性，包括迁移性、侵袭性以及一些干细胞的特征[15]，EMT的分子机制非常复杂，其中Twist是调控EMT的关键因子[16,17]，Alexander等[18]在前列腺癌的研究中发现Twist可以诱导N-cadherin表达，同时抑制E-cadherin表达[19]。E-cadherin在正常上皮组织中具有维持细胞间紧密连接、限制细胞运动和转移的作用，N-cadherin主要分布于神经及内皮细胞间叶组织中，其作用与细胞运动和侵袭能力相关[20]。此外，Twist还可促进Vimentin的表达[21]，Vimentin是间质细胞中的中间纤维，与微丝和微管共同构成了细胞支架网络[22]。已有文献报道了MMP14在诸如卵巢癌等肿瘤细胞中对EMT的促进作用[23,24]，本研究发现在PTC细胞B-CPAP中，MMP14过表达可显著降低E-cadherin的表达，促进N-cadherin、Vimentin、Twist的表达，miR-369-3p可降低MMP14对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist的调控作用，表明MMP14可促进EMT，miR-369-3p可通过抑制MMP14的表达降低EMT水平，进而抑制PTC细胞的侵袭和迁移。

在前人的研究中，Overland等[25]报道了一种全新的EGFR反式激活机制，MMP14作为G蛋白的效应器，可被活化的G蛋白直接激活，MMP14促进肝素结合类表皮生长因子(Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor,HB-EGF)的释放进而激活EGFR的活性。EGFR信号级联放大是诱导EMT和肿瘤细胞转移的关键信号通路，可通过ERK1/2信号途径诱导EMT[26,27]。研究表明，ERK1/2可上调MMP-2蛋白酶的表达，MMP-2具有降解基底膜胶原的能力，是肿瘤转移不可缺少的组分[28]。此外，EGFR还可以通过MAPK和PI3K等信号级联调控VEGF表达，VEGF对肿瘤血管生成具有关键性作用[29]。本研究发现，MMP14过表达可显著提高EGFR-ERK信号通路中EGFR、p-ERK1/2、VEGF和MMP2的蛋白表达水平，miR-369-3p可抑制MMP14诱导的EGFR、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2蛋白表达，表明MMP14通过调控EGFR-ERK信号通路，促进了肿瘤细胞的侵袭和迁移，miR-369-3p可抑制MMP14的表达从而阻断EGFR-ERK通路，进而降低肿瘤细胞的侵袭和迁移。

综上所述，MMP14能够通过诱导EMT提高PTC细胞的侵袭和迁移，其机制与EGFR-ERK信号通路相关。miR-369-3p可靶向作用于MMP14，降低MMP14表达水平，从而抑制EGFR-ERK信号通路，阻碍EMT进程，抑制PTC细胞的侵袭和迁移，为PTC治疗提供了新的靶向治疗分子。后期计划构建PTC荷瘤小鼠模型，进一步研究miR-369-3p对PTC荷瘤小鼠肿瘤生长、侵袭和迁移的影响。